| 研究課題/領域番号 |
18K06116
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| 研究機関 | 岩手医科大学 |
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研究代表者 |
久保田 美子 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (30260102)
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| 研究分担者 |
古山 和道 岩手医科大学, 医学部, 教授 (80280874)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / ヘム / プロテアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
ヘム結合型ALAS1をClpXP複合体がどのように認識し、分解するのか、分子機構を明らかにするための実験系の確立を行った。ミトコンドリア内タンパク質分解のモデル基質としてオルニチントランスカルバミラーゼのミトコンドリア移行配列とルシフェラーゼタンパク質を融合させたものを用意した。このルシフェラーゼのN末端にヒトALAS1のミトコンドリア移行配列を除いたN末端約90アミノ酸を挿入することによってヘム依存的にルシフェラーゼが分解するかを検出する。上記の融合タンパク質の発現ベクターをFlp-InT-Rex-293細胞に導入し、テトラサイクリンによって発現誘導可能な安定発現株を単離した。ヘミンを培地に加えることによってヘム依存的融合タンパク質の分解が確認され、ClpXPとの相互作用も確認された。一方、ALAS1 N末端配列を含まない融合タンパク質、ALAS1 N末端配列中のヘム結合モチーフの変異タンパク質、いずれにおいてもヘム依存的分解は認められず、ClpXPとの相互作用も認められなかった。これらのことから、ALAS1 N末端由来配列をもつミトコンドリアマトリックスタンパク質は、ヘムが結合するとClpXPと相互作用して分解へ導かれる可能性が示唆された。さらに、このALAS1 N末端由来配列中の哺乳類で保存されたアミノ酸のいくつかについて変異を導入してヘム依存的分解とClpXPとの相互作用について解析を進めている。また、CLPXについてもFlp-InT-Rex-293細胞のゲノムCLPX遺伝子をノックアウトした細胞にテトラサイクリンによって誘導可能なCLPX発現ベクターを導入し、安定発現株を樹立した。CLPXの変異体発現細胞も作成しており、現在までにN-ドメインの6アミノ酸を欠失したものではALAS1との相互作用が失われることを確認している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していたALAS1由来配列をもったミトコンドリアマトリックス融合タンパク質を用いた実験系の確立は完了した。さらにこのALAS1配列が存在しない場合や、変異を導入した場合、ヘム依存的分解やClpXPとの相互作用が失われることが確認できたので、ヘム濃度に反応してタンパク質を分解に導く新規のデグロン配列を含むペプチドを得ることができたと考えている。また、得られたデグロンの分子メカニズムを明らかにするため、変異体の解析も開始している。
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| 今後の研究の推進方策 |
既に、デグロンの変異体をいくつか作成しており、これらのヘム依存的分解のキネティクスやClpXPとの相互作用を解析することによって、ヘム結合型ALAS1がClpXPによって認識される仕組みを明らかにする予定である。また、これらの変異体が酸化されているかを、カルボニル化を指標としたウエスタンブロッティングで確認する。特に2019年度はALAS1由来デグロンがリン酸化されているか、もしされているならばリン酸化状態によってClpXPによる認識に影響を与えるのかについて明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬や実験器具類の定価と納品価格の差などに起因するものであり、当初の計画通りの使用状況である。
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