| 研究課題/領域番号 |
18K06119
|
|---|
| 研究機関 | 金沢医科大学 |
|---|
研究代表者 |
田崎 隆史 金沢医科大学, 総合医学研究所, 准教授 (70629815)
|
|---|
| 研究分担者 |
佐々木 宣哉 北里大学, 獣医学部, 教授 (20302614)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | ユビキチンリガーゼ / UBR4 / DSS誘導大腸炎モデル / 網羅的遺伝子発現解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
ユビキチンリガーゼUBR4はタンパク質のユビキチン化を担う翻訳後修飾酵素で、腎臓足細胞のポドシンやミトコンドリアPINK1の安定性、ヒトパピローマウイルスによる発がん、オートファジー経路等、多種多様な生理現象に関わっていることが示唆されている。
本研究では、成体における生理学的役割とその分子機構を明らかにするために、コンディショナルノックアウト（CKO）マウスを用いて組織特異的にUBR4遺伝子を不活化させ、個体及び遺伝子発現の変化を解析する。それと並行して、特定の臓器や細胞系からUBR4結合タンパク質を精製し、既存および未知の標的基質の同定を試みている。
平成30年度では、腸管上皮特異的UBR4遺伝子欠損マウスを作製し、DSS誘導大腸炎モデルにおける表現型を解析した。その結果、UBR4欠損マウスではDSS投与により、対照群（野生型マウス）よりも大腸炎が劇症化することを見出した。一方、DSS非投与群では異常は見られなかった。この結果は、腸管上皮細胞のUBR4がDSS投与による大腸炎誘導メカニズムに重要な役割を担っている可能性を示唆している。そこで、令和元年度において、網羅的な遺伝子発現解析をRNA-seq法により実施した。DE分析により、少なくとも29個の遺伝子がDSS処理Ubr4 KOマウスで特異的に変化したことが示され、 これらの遺伝子の内、14の減少遺伝子が炎症と自然免疫応答に関係していた。以上の結果から、腸上皮特異的なUbr4遺伝子欠損は、インフラマソームの低下により、DSS誘導大腸炎が悪化することが示唆された。次に、UBR4特異的な細胞内機能の解析を行うために、HEK293細胞をモデルとしてUBR4欠損細胞を確立した。このHEK293UBR4欠損細胞を用いて、RNA-seq法により網羅的な遺伝子発現解析を行った。多数の変動遺伝子が確認され現在解析中である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度に様々な組織特異的UBR4欠損マウスを作製し、腸管上皮細胞特異的UBR4マウスにおいて、DSS誘導大腸炎が劇症化することを見出した。この結果から、UBR4がDSS誘導大腸炎メカニズムにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されたので、令和元年度に、腸管上皮細胞特異的UBR4マウスを用いた網羅的な遺伝子発現解析をRNA-seq法により実施した。DE分析により、少なくとも29個の遺伝子がDSS処理Ubr4 KOマウスで特異的に変化したことが示され、 これらの遺伝子の内、14の減少遺伝子が炎症と自然免疫応答に関係していた。以上の結果から、腸上皮特異的なUbr4遺伝子欠損は、インフラマソームの低下により、DSS誘導大腸炎が悪化することが示唆された。
次に、UBR4特異的な細胞内機能の解析を行うために、HEK293細胞をモデルとしてUBR4欠損細胞をCRISPR-CAS法を用いて確立した。その結果、2系統のUBR4欠損細胞と1系統のUBR4ヘテロ欠損細胞を得た。これらの細胞とHEK293を用いて、RNA-seq法により網羅的な遺伝子発現解析を行った。多数のUBR4特異的変動遺伝子が確認され現在解析中である。
UBR4結合タンパク質の同定において、UBR4精製用ペプチドビーズおよびUBR4結合性のHPV-E7タンパク質を用いた精製法の確立を試みたが、大腸菌発現系によるHPV-E7の純度が低い問題に直面した。そこで、近位依存性ビオチン標識法によりUBR4結合タンパク質の同定を計画している。これまで、BioID2タグ化UBR4発現プラスミドとBirA(R118G)タグ化UBR4発現プラスミドを作製した。
以上の結果から、現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると言える。
|
| 今後の研究の推進方策 |
これまでの腸管上皮細胞特異的UBR4遺伝子欠損マウスを用いた実験では、3％DSSを用いて大腸炎モデルを作製した。この条件ではこの条件での再現性を確認するとともに、DSS濃度を低下させた条件でも野生型より大腸炎の劇症化がみられるのかどうか検討する。次に、網羅的遺伝子発現解析によって得られた結果から、インフラマソーム関連遺伝子を対象に遺伝子及びタンパク質発現解析を進めることを計画している。一方、HEK293細胞を用いたUBR4欠損細胞の網羅的遺伝子発現解析によるデータ解析を進め、UBR4の腸管上皮細胞内での生理機能の解明につなげたい。
UBR4精製用ペプチドビーズおよびUBR4結合性のHPV-E7タンパク質を用いた精製法の確立を試みたが、大腸菌発現系によるHPV-E7の純度が低い問題に直面した。そこで、近位依存性ビオチン標識法によりUBR4結合タンパク質の同定を計画している。令和元年度に作製した二種類のビオチン標識タグ化UBR4発現プラスミドを、HEK293細胞およびUBR4欠損細胞に導入し、ビオチン化タンパク質を精製・同定することを推進する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画で2019年度予算に計上していた、論文投稿費（校正費含む）350,000円を使用しなかったため次年度使用額が生じた。2020年度に使用することを計画している。
|
