| 研究課題/領域番号 |
18K06132
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
前濱 朝彦 神戸大学, 医学研究科, 准教授 (40322755)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、PICT1を基点として核小体ストレス応答の分子機構の解明を目指すとともに、核小体ストレス応答を担う分子の遺伝子改変マウスを作成してがん制御との関連を明らかにすることを目標としている。
これまでの私達の研究から、非ストレス下ではPICT1は安定化因子Xと結合することで安定化されているが、核小体ストレス下ではXがPICT1から解離することでPICT1が不安定化し分解されることが明らかにされている。本年度はPICT1およびXがRNA結合ドメインを有することから、これらに結合するRNA分子、そしてその核小体ストレスによる変化を解析した。PICT1の酵母オルソログNop53pはリボソームRNAのプロセッシングに関与することが報告されているため、まずPICT1とリボソームRNAとの結合をRNA-IP法にて解析した。その結果、PICT1が45SリボソームRNA前駆体のITS1、ITS2領域と結合することを見出したが、核小体ストレスによるこれらの変化は観察されなかった。また、RNA-seqによるPICT1およびXに結合するRNA分子の包括的解析に向けた条件検討も併せて行った。
さらに安定化因子Xは種々の癌組織において発現量亢進が認められる分子である点に着目し、Xと発がんとの関連を明らかにする目的でCRISPR-Cas9を利用しX遺伝子欠損マウスの作成を開始した。X遺伝子イントロン領域を標的としたsgRNAを複数作成しloxP配列を有するオリゴDNAと共にマウス胚へのインジェクションは既に複数回行い、現在は遺伝子タイピングによって遺伝子Xのfloxアレルを有するマウスの検証を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度の研究ではPICT1およびXに結合するRNA分子の解析法の確立が大きな到達目標の一つであった。この点については概要に記したように、PICT1のRNA-IPによる結合RNAの解析手法は確立し、またRNA-seqによる包括的解析に向けた準備も着実に進んでいる。一方XのRNA-IPに関してはIPに利用できるタグに制限があることが明らかとなり、手法の改良を必要としたが現在は概ね順調に計画が遂行できている。また関連遺伝子の改変マウス作成に関しても、CRISPR-Cas9を利用してX遺伝子改変マウスの作成に既に取りかかっており順調に推移している。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初研究計画に従い、以下の点を中心に研究を進める。
（１）PICT1およびXに結合するRNA分子の包括的解析。またその核小体ストレスによる変動。
（２）PICT1-X結合に関わるRNA分子や翻訳後修飾の同定・解析。
（３）X遺伝子欠損マウス、X遺伝子トランスジェニックマウスの作成。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度に予定していたRNA-seq解析に先んじてPICT1のRNA-IP解析を行ったため、RNA-seq解析のために計上していた予算が未使用となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。
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