| 研究課題/領域番号 |
18K06153
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
大岡 宏造 大阪大学, 理学研究科, 准教授 (30201966)
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| 研究分担者 |
熊崎 茂一 京都大学, 理学研究科, 准教授 (40293401)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 光合成 / 反応中心 / 電子移動 / キノン / FTIR / 超高速分光 / ヘリオバクテリア / 緑色イオウ細菌 |
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| 研究実績の概要 |
１．ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析：米国グループが2017年に報告した高分解能データ（2.2オングストローム）を目指してスクリーニング方法や凍結方法などの改良を試みた。異なる空間群の結晶（C2とR32）が得られており、目標であった高分解能に到達することに成功した。米国グループに存在していなかったキノン分子が、我々の構造中には存在していることが明確になった。構造の相違は、電子移動反応の素過程を反映していると考えられる。
２．緑色イオウ細菌反応中心の結晶化・構造解析：微結晶が得られたものの、その後の結晶化標品の改良を試みたが上手くいかなかった。並行してクライオ電子顕微鏡解析を進めており、解析可能な単分散グリッド作成が可能であることを確認している。
３．ヘリオバクテリア反応中心の極低温下での1分子分光：ヘリオバクテリア反応中心には一次電子受容体A0として、8(1)-OH-Chl aが2分子存在する。極低温下（６ K）においてChl a-A0の蛍光励起スペクトルを測定したところ、室温では670 nmのシングルピークを示していたが、2つのピークに分裂することが分かった。ヘリオバクテリア反応中心は完全対称（C2対称）のホモダイマー型である。このことは、極低温下では分子の揺らぎが抑えられ、分子1個のレベルで観察するとheterogeneityを示すことを意味する。さらにphotobleachによるChl a-A0の蛍光励起スペクトル変化から、両サブユニットに存在する色素間では互いにエネルギーのやり取りを行っていることも示唆された。
４．フーリエ変換赤外分光法（FTIR）によるキノール生成の検出：膜標品を用いて光誘起FTIR差スペトルを測定したところ、S/N比はよくないが、1420 cm-1付近にキノール生成に由来する可能性のある信号を検出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヘリオバクテリア反応中心の構造基盤に関わる解析については順調に進展し、目標とする分解能に達することに成功した。FA/FBタンパク（PshB：2[4Fe-4S]型クラスター）との共結晶化を試みていたが、回折像が得られたものの分解能向上には至らなかった。そのため、現在はコアタンパクのみの解析データをまとめることにし、当初の投稿予定の時期よりも遅れたが、現在、投稿に向けて鋭意努力している。また緑色イオウ細菌反応中心の結晶化・構造解析については、回折実験可能な分解能が得られず、微結晶標品の改良には至らなかったので方針転換が必要である。
一方、ヘリオバクテリア反応中心の立体構造中には長く議論の的となっていた二次電子受容体キノンが見出された。このことはこれまで知られていない未知の電子移動反応・経路が存在している可能性があり、これまで試していない分光学的解析が必要となってきた。そこでまずはフーリエ変換赤外分光（FTIR）を用いることで、光駆動反応によるキノン還元（キノール生成）を検出する試みを実施した。しかしながらFTIRに適した膜標品調製に手間取り、現在、再現性のある分光データ取得が非常に苦慮している。
さらにヘリオバクテリア反応中心の電子移動経路を再検討するために、超高速分光によるサブピコ秒からナノ秒までのスペクトル変化（400-900nm）の時間展開を丹念に調べなおすことを始めた。励起波長としては670, 770, 810 nmを用い、励起光強度は5 nJ/pulse、レーザーパルスは1 kHzの繰り返し（1 msおきの照射）とした。現在、結果について解析中である
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| 今後の研究の推進方策 |
反応中心の構造基盤に関わる解析については、クライオ電子顕微鏡による解析を進める予定である。ヘリオバクテリア反応中心はシトクロムc（PetJ）とFA/FBタンパク（PshB：2[4Fe-4S]型クラスター）をサブユニットとしてもつ複合体であるが、RCの可溶化・精製段階で容易に外れてしまう。すでにPetJ およびPshBサブユニットの大腸菌による大量発現系を構築済みであり、in vitroでの再構成後、構造解析に取り組む。一方、緑色イオウ細菌反応中心はすでにコアタンパクPscAに精製用Hisタグを付加したコンストラクトを作成し、RCの大量調製は可能である。すでにクライオ電子顕微鏡による解析を進めており、本年度中の解析終了を目指す。
またヘリオバクテリア反応中心に見出されたキノンの機能を調べていくために、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）による解析を進めていく。現在、1420 cm-1付近にキノール（QH2）に由来するかも知れない信号の蓄積を検出している。QH2由来の信号であるかどうかは、今後、13Cキノンへの置換等により信号がシフトすることを確認する必要がある。同じく膜標品を用いて1200-1000 cm-1付近に大きく変化する信号が観測されており、光照射によるキノン結合部位周辺の構造変化が検出されている可能性が示唆された。15N置換等により、構造変化を引き起こしたアミノ酸部位の特定を進めていく。
さらに超高速分光測定で得られたデータの解析を進めていく。低温（77 K）スペクトルでは、4つのスペクトル成分（B776, B787, B800, B312）が観測されている。すでに異なる励起波長（670, 770, 810 nm）によりデータを取得済みであり、スペクトル成分間でのエネルギー移動の様子の違いと、初期電荷分離反応に至るスペクトル成分の解析に興味がもたれる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）現在までの進捗状況で述べたように、今年度は反応中心の分光学的解析に使用する標品調製、およびデータ解析に時間が費やされた。そのために反応中心の構造解析に必要な標品を大量に調製することがなかった。そのため膜タンパク質可溶化に必要な界面活性剤の使用頻度が低く、精製に必要なNi樹脂の新規購入も見送った。これらの理由により、次年度の予算使用額が生じた。
（今後の使用計画）次年度の研究遂行に必要とされる試薬類の購入費として使用予定である。
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