| 研究課題/領域番号 |
18K06154
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
宮崎 直幸 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (00634677)
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| 研究分担者 |
内山 淳平 麻布大学, 獣医学部, 講師 (20574619)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 構造解析 / ファージ / ファージ療法 / 感染機構 |
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| 研究実績の概要 |
平成３０年度は、黄色ブドウ球菌ファージS13’の宿主認識とゲノム注入に関わる分子装置の仕組みを原子レベルで理解するために、クライオ電顕単粒子解析法を用いて、黄色ブドウ球菌ファージS13’を構成する全タンパク質の原子モデルの決定を目指して研究を進めてきた。研究費の申請時において、既に構造解析に必要となるクライオ電子顕微鏡写真の撮影と、頭部と尾部の主要部分に関しては、原子モデルの構築ができていたが、尾部先端領域等で宿主認識に関わるタンパク質など機能的に重要な部位の構造は決めることが出来ていなかった。特に、尾部には対称性のミスマッチがいくつも存在し、通常の解析ではその全体の構造を決定することは不可能であった。そこで、今年度は、それら原子モデルの構築がまだ出来ていなかった尾部の先端領域や頭部のマイナー構成要素であるタンパク質の原子モデルを構築するために、Focused classificationとrefinementの方法の条件検討をおこなった。その結果、頭部ファイバーを構成するgp14と尾部の最も先端に位置するgp11の一部構造を除いて、黄色ブドウ球菌ファージS13'を構成するほぼ全ての原子モデルの構築に成功した。gp11に関しては、原子モデルの構築は出来なかったが、尾部先端において２量体で存在していることが判明した。そして、その決定した原子モデルから、ファージの構成要素タンパク質が機能的に配置されている様子を明らかにすることができた。今後、これらの分子装置が実際どのように動作しているのか変異体実験や宿主へのゲノム注入後の構造を調べることにより解明する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、精製した黄色ブドウ球菌S13’のクライオ電顕単粒子解析において、これまで構造決定が出来ていなかった、尾部の先端領域や頭部の内部等の機能的に重要な部位の原子モデルの構築を計画していた。特に、尾部には対称性のミスマッチが存在し、通常の解析ではその全体の構造を決定することは不可能であった。そこで、Focused classificationとrefinementの方法を検討し、局所的領域での構造分類をおこなうことによって、尾部のほとんどの領域の原子モデルを構築することができた。そして、その構築した原子モデルから、ファージの宿主との相互作用様式や、ゲノムを宿主細胞へ注入する際の構造変化を推察することができた。現在、それを実証するために、尾部を構成するタンパク質の発現系の構築と変異体作製に取り組んでいる。従って、当初予定した通り研究が進展しているので、進捗区分としては、「おおむね順調に進展している」という判断に至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成３０年度は、黄色ブドウ球菌ファージS13’のほぼ主要部分の原子モデルの構築に成功し、ファージの構成要素タンパク質が機能的に配置されている様子を明らかにすることができた。今後は、これらの分子装置が実際どのように動作しているのか調べていく。まずは、ゲノムを宿主へ注入した後の構造解析に取り組むことで、ゲノム注入装置である尾部の構造変化や動作機構を明らかにする。このゲノム注入後の構造を決定するために、精製したファージを黄色ブドウ球菌へ一旦吸着させてゲノムを放出させた後に、界面活性剤を用いてファージを菌体から温和に剥離させて、それを精製しクライオ電顕単粒子解析により構造解析をおこなう。ゲノムを放出したファージ粒子は、頭部の密度が低くなっているので、放出前の粒子と画像中で区別ができると考えられる。また、ファージの感染中の構造変化を経時的に調べるために、位相差クライオ電子線トモグラフィーにより、in vivo解析を進める。黄色ブドウ球菌とファージを混ぜてから、凍結するまでの時間を調節することで、感染段階の異なる試料を作製し、感染過程で生じるファージと宿主との相互作用やそれに伴い生じる構造変化の過程を詳しく解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
平成３０年度は、解析をおこなう計算機購入のため前倒し請求をおこなった。一方で、論文投稿費用として形状していた費用が、今年度論文投稿が間に合わなかったので、次年度使用することにした。
（使用計画）
当初の予定どおり、論文作成および投稿の際の費用として、次年度に使用する。
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