| 研究課題/領域番号 |
18K06160
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| 研究機関 | 首都大学東京 |
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研究代表者 |
池谷 鉄兵 首都大学東京, 理学研究科, 助教 (30457840)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 溶液NMR / 蛋白質立体構造 / 常磁性効果 / 信号処理 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は，YUH1蛋白質をモデル試料として，複数の異なるNMRデータを統合し，複数状態を仮定して解析するアンサンブル構造解析法の開発に成功した．これにより，ダイナミクスの大きな蛋白質をアンサンブル構造として表現することが可能となった．ここで用いたデータには，NOE, 化学シフトなど，従来から用いられてきた近距離の構造情報に加え，残余双極子相互作用(RDC)，常磁性緩和効果(PRE)，疑似コンタクトシフト(PCS)などの遠距離情報も含まれる．これだけ複数のデータを統合解析し，de novo立体構造決定に成功した例はほとんどなく，本年度の大きな進展である．また，複数データの同時解析で生じるデータ間の不整合性は，構造を複数状態に仮定することで解決した．本手法により得られたYUH1のアンサンブル構造は，従来法では，構造が一意に決まると考えられた領域においても，ある範囲の構造分布を持つことが示された．特に，YUH1のN末端領域の機能については，これまでほとんど未知であったが，本手法で得られた構造アンサンブルから，新たな触媒活性機構の仮説を提案できた．さらに，この仮説検証のために，N末端領域の変異実験を行ったところ，予想通りYUH1の酵素反応速度が大きく低下した．これは，YUH1のアンサンブル構造から予想された反応機構を裏付ける結果となった．本研究は，現在学術雑誌への投稿を準備中である．
また，常磁性効果を利用して，マルチドメイン蛋白質であるポリユビキチンとGRB2の溶液中でのドメイン配向決定の構造解析を行った．ポリユビキチンおよびGRB2の全体構造は，すでにX線結晶構造解析により明らかになっているが，本研究により，溶液中でのドメイン配向が結晶中の構造を異なることを示唆する結果が得られている．現在，これらの構造についての検証実験を進めている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は，複数の状態を仮定して，異なるNMRデータを統合解析することで，ダイナミクスの大きな蛋白質の構造をアンサンブルとして可視化する手法の開発に成功した．これにより，X線結晶構造解析では一意に定まると考えられていたYUH1の活性部位付近の構造は，溶液中では，非常に大きなダイナミクスを持っていることが明らかになった．アンサンブル構造の分布の広がりが大きい領域は，YUH1の活性部位周辺に集中しており，この分布には偏りも見られたことから機能との関連性が示唆された．分布から予想された触媒機構を検証するため，アミノ酸変異実験を行ったところ，予想通りの酵素反応速度の低下が見られた．アンサンブル構造解析法の開発に成功し，ここから得られたアンサンブル構造を基に，YUH1の機能解析に繋げられた点は，本年度の大きな進展である．本研究で用いた複数のNMRデータには，常磁性効果を利用した遠距離データも含まれており，本研究提案の１つめの課題である常磁性効果の効率的な解析手法の確立という観点で，研究計画当初に期待していた成果が得られた．YUH1以外の蛋白質については，現在2つのマルチドメイン蛋白質の常磁性NMR測定に成功している．異なる常磁性金属結合タグと，複数のランタノイド金属を用いることで，様々な空間距離・角度の情報の所得に成功した．現在，得られた構造情報を元に立体構造計算を進行中である．次年度中にも，これらのマルチドメイン蛋白質の詳細な構造決定が可能である見通しであることから，ドメイン配向決定の構造計算も概ね研究計画通りに進行中である．
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は，常磁性効果などの遠距離のNMRデータを統合し，複数の構造状態を仮定することで，蛋白質立体構造のアンサンブルを推定可能な手法を確立できた．よって，次年度は本手法をより多くの試料に適用し，汎用的な手法へと拡張させる．具体的には，マルチドメイン蛋白質のドメイン配向決定に応用する予定である．さらに，本アンサンブル構造解析法を，SAXSなどのNMR以外の溶液分光データにも拡張することを目指す．現在，CYANAソフトウェアにSAXSデータを解析可能な関数を実装中であり，次年度中の開発を目指す．
新規信号処理法の開発では，現在のプログラムは，2次元のNMRスペクトルのみに適用可能な暫定的なものであるため，これをより高次元のスペクトルにも適用可能な汎用的な手法に拡張する．この手法を，複数のシミュレーションデータと実測データに適用し，従来法と性能比較を行うことで，本手法の有効性を検証する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
蛋白質調製に必要な実験試薬の購入が，予定より安価に済んだため，一部次年度に繰り越すこととした．繰り越した予算は，実験試薬等の消耗品の購入に充てる予定である．
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