| 研究課題/領域番号 |
18K06172
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
重松 秀樹 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (00415928)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 電位依存性 / 可視化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、膜電位依存的なイオンチャネルの機能構造を明らかにするために、脂質小胞に再構成したイオンチャネルの構造クライオ電子顕微鏡単粒子解析により取得し、脂質小胞に異なる膜電位を印加した際のチャネルの電位依存的な構造変化を改造することを目的にしている。これまでに米国Yale大学のFred Sigworth教授と共に方法論開発を進めており、電位センサーである膜貫通ヘリックスの相対配置の解像に成功している。研究の進め方として、初年度に当たるH30年度では、電位センサーの一部分の解像度が低くなっている点を改善することを計画していた。
電位センサーである膜貫通ヘリックスの解像度は、イオンチャネル全体の構造に対してノイズが目立っている。これは脂質膜に埋め込まれた状態を直接観察しているために仕方ないとも言える。そこで、全体の解像度を底上げすることで、膜貫通ヘリックスの部分についてもよりクッキリと解像できるように、画像データを大量に取得することを計画した。これまでの結果から、データセットを増やすことで、分解能を5オングストローム程度まで向上させることが可能であると予想していたが、予想以上にリポソームを固定する炭素支持膜のノイズが問題となり、分解能の向上が難しかった。現在、ノイズの少ない代替支持膜として同じ炭素材料のグラフェンの利用を検討している。
電子顕微鏡試料を用いて、他の手法で電位依存的な構造変化の評価するために、膜電位の変化を蛍光色素で評価する系を導入している。これまでには、予想に反してシグナルが小さく、リポソームからの内容物の漏えいなどの問題が懸念されていたが、蛍光色素およびその固定化方法を検討することで、我々が構造解析する試料においても、試料凍結までに膜電位が十分な時間保持されることが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度はYale大学のTitan Kriosの利用を念頭に系の再検討を行ってきたが、マシンタイムを定期的に確保することが難しく、また、国内での予備実験についてもAMED BINDSとクライオ電顕ネットワークを利用したマシンタイムの確保が十分にできなかった。平成30年度末に新規にクライオ専用電顕を理化学研究所放射光科学研究センターに導入したことで、令和元年度以降はその問題点を改善できる体制が整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
ノイズの問題からグラフェンの利用を検討しているが、歩留まりが悪いこと、リポソームとグラフェンの親和性を改善するための検討が必要なことが明らかになってきている。現在、プラズマを使ったドライプロセスでの処理を検討しているが、ウェットプロセスについても検討することで、問題解決を図りたい。電位のかかった状態を維持できるという結果が以前よりは確度の高いものであると考えているので、グラフェンの機能化を果たし、最終年度には分子動力学計算を開始したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H30年度は、所属機関で電子顕微鏡を調達していたために、外部へ出かけての使用することになり、使用機会がそれほどなく、消耗品の使用が予定ほどではなかった。年度末に納品完了した装置を持って次年度以降に消耗品の購入費用として使用する予定
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