| 研究課題/領域番号 |
18K06187
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
井手 聖 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 助教 (50534567)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | リボソームRNA遺伝子 / クロマチン / 神経疾患 |
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| 研究実績の概要 |
リボソーム合成工場である核小体には、大量のリボソームRNA（rRNA）を供給するためにリボソームRNA遺伝子（rDNA）が局在し、転写因子UBFがrDNA領域全体に結合することでユニークなクロマチン構造を形成している。本研究では、神経変性疾患の原因として同定された変異型UBFがrRNAの転写を亢進させハイパーアクティブ状態へと引き上げるクロマチンの構造変換の仕組みを明らかにすることを目的としている。変異型UBFにより引き起こされる核小体クロマチンの構造変換を、研究代表者自身が開発した二つのオリジナルの方法で評価した。①超解像顕微鏡を用いて生きている細胞内で正常型UBFと変異型UBFの動きを一分子レベルで観察した。驚くべきことに、変異挿入によりその動きに大きな変化は見られなかった。②次に、rDNA自身の動きから、クロマチンの凝縮具合を測定するために、rDNAを直接部位特異的にCy3-dCTPでラベリングする方法を新たに確立した。現在、その方法により変異型UBFを発現後にrDNAの動きがどのように変化するかを検証している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遺伝子クローニングの際にUBFが大腸菌に対して毒性を示すことや培養細胞でUBFを過剰発現した際に核小体外へ異常局在するなどの問題に遭遇し、トラブルシューティングを行ったため、変異型UBFの一分子イメージングの結果を得るまでに予定より時間を有した。一方、rDNA特異的にラベリングする系は順調に確立できた。一つ気がかりな点は、これまでの結果によると培養細胞の系では変異型UBFが大きなクロマチン構造変換を引き起こさない可能性が示唆されているので、それについての対策を講じる必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
超解像顕微鏡を用いた転写因子UBFの一分子観察では、変異型UBFの動きに大きな変化が検出できなかったが、その理由として以下に示すことが考えられる。現在の一分子イメージングでは、がん細胞であるHeLa細胞を用いている。そのため、すでに核小体クロマチンがハイパーアクティブ状態になっており、その効果が見られなかった可能性が考えられる。そこで、正常細胞であるRPE1細胞などで同様の実験を行う。また、培養細胞内において変異型UBFが大きなクロマチン構造変換を誘導することが難しい可能性も考えうるので、バックアップの実験として神経疾患の原因として新たに検出された核小体クロマチン因子の変異についての解析を横浜市立大学松本直通先生と共同で行う準備をしている。
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