| 研究課題/領域番号 |
18K06195
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
小口 祐伴 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (40599370)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | シーケンス技術開発 / １細胞トランスクリプトーム解析 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本件は，非増幅シーケンサー(PCRによってサンプルを増幅することなく，1分子単位に対象DNA配列を決定できるシーケンサー)に適用可能なシーケンスライブラリの調製方法を確立することを目的とする．この実現のために当初は，非増幅シーケンサーのフローセル（シーケンス反応槽）内部でライブラリ調製を試みる方法(On-chip法)と，フローセル外部で試みる方法(Off-chip法)の2つのアプローチを計画した．本年度は昨年の進捗状況を考慮し，引き続きoff-chip法に関する検討を中心に進めた．
Off-chip法の検討として，昨年度に見出した非共有結合(ビオチン-アビジン相互作用)を介したサンプルの捕捉を活用した非増幅シーケンスの実施，その基本データを取得した．
具体的には，シーケンスフローセル外にて，ビオチンを有するオリゴプライマーを介して2本鎖cDNA配列を合成する(一方の鎖にのみビオチン分子が付加される．またこれはPCRによって増幅しない)．他方，フローセルにはアビジン分子を固定しているので，ビオチンを有する2本鎖cDNAをこれに流し込むと，フローセルに捕捉される．捕捉後，フォルムアミド溶液(濃度を適切に調製した)を活用することで，2本鎖cDNAはビオチン-アビジン結合を維持したままに1本鎖化される．このフローセル上に残る1本鎖cDNAの配列情報の取得を，非増幅シーケンサーにより実現した．従来は，解析対象となるDNA分子のフローセルへの捕捉は，これに相補的に結合するオリゴヌクレオチド分子をフローセルにあらかじめ固定することで実現していたが，これに比べると，汎用性の高い方法が確立した．この解析例を報告の基本とした論文を作成し，論文は現在査読の過程にある．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はoff-chip法にて，ビオチン化2本鎖cDNA配列を基板上に捕捉し，その捕捉状態を維持したままに1本鎖化する技術を確立した．これにより，off-chip法の実現性が大いに高まった．基礎的なデータを取得し，論文作成・投稿にまで至った．成果としては論文化に至ったなど，進捗もあるが受理の段階には至っておらず，概ね順調な進捗と判断した．
|
| 今後の研究の推進方策 |
現在投稿中の論文の査読への対応と並行して，off-chip法の活用例を拡げるような検討を進め，次の論文化に繋げたい．
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度としては当初の予定通り助成金を使用できている．本年度に生じた次年度使用額は主に前年度未使用分に相当する．本年度は論文作成等に時間を費やしたが，次年度には実験回数も多くなることが見込まれるため，それに必要となる消耗品類の購入に使用を計画している．
|
