| 研究課題/領域番号 |
18K06200
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
高橋 正行 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (50241295)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞遊走 / 細胞骨格 / 接着斑 / 正常線維芽細胞 / 細胞の不死化 |
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| 研究実績の概要 |
正常線維芽細胞は一度遊走方向が決まると長時間にわたってその方向を維持することができる。さらに、遊走が停止していると考えられていたコンフルエント状態においてもこの性質は維持され、正常線維芽細胞は巧みにすれ違いながら動き続けられる。本研究では、正常線維芽細胞のこの強固な方向持続的遊走を可能にする分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。昨年度、ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞 WI-38細胞とその不死化細胞株のWI-38 VA13細胞の細胞骨格画分をLC/MS/MS解析によってタンパク質の同定・比較定量を行なった結果、ほとんどの細胞骨格と細胞接着にかかわるタンパク質が不死化によって減少することがわかった。今年度は、その中でLMO7とTalin-1に注目し、ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞であるTIG-1細胞を用いて、それらの方向持続的遊走における役割について解析し、以下の結果を得た。
(1) 免疫蛍光染色により、LMO7は細胞の遊走方向に対して後方のストレスファイバーに局在することがわかった。これはミオシンIIBの局在と類似していた。LIM domain only protein 7 (LMO7) をsiRNAを用いてノックダウンすると、細胞の形態は丸みを帯び、ミオシンIIBの後方への偏った局在が見られなくなった。タイムラプス観察により、LMO7ノックダウン細胞はランダムな方向に遊走することがわかった。
(2) 免疫蛍光染色により、Talin-1は接着斑に局在すること、また、Talin-1をノックダウンするとVinculinの斑点状の局在が消失したことから、正常線維芽細胞においてもTalin-1が接着斑の成熟に関与していることが確認された。また、Talin-1ノックダウン細胞の中には、他の細胞と接触した際に遊走方向を反転させる現象を見せる細胞が多く見られるようになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度、正常線維芽細胞（WI-38）と不死化線維芽細胞（WI-38 VA13）の間で存在量の異なる細胞骨格因子をプロテオーム解析によって比較定量し、WI-38細胞において存在量が多いタンパク質をいくつか同定した。今年度は、その中で、LMO-7とTalin-1の局在や、それらのノックダウンが細胞遊走に及ぼす影響を、遊走方向の維持がより顕著に見られるヒト胎児肺由来正常線維芽細胞のTIG-1細胞を用いて解析し、いくつか興味深い知見を得ることができた。
著しく存在量の差が大きい（WI-38細胞の方が77倍多い）タンパク質として同定したLMO7は遊走時の正常線維芽細胞の後方（特に細胞周縁部）のストレスファイバーに多く局在することが免疫蛍光染色により示された。この局在は、私たちが正常線維芽細胞の方向持続的な遊走への関与を示したミオシンIIBの局在と非常に良く似ている。アクチン骨格に対するLMO7の未知の役割を明らかにできる可能性を示す結果と考えられる。
正常線維芽細胞は、細胞同士が正面から接触した際に、いわゆる細胞遊走の接触阻害（Contact inhibition of locomotion：CIL）によって遊走方向を反転させるが、側面で接触した際には、お互いに離れようとはするが、できるだけ遊走方向を維持しようとし方向を反転することはないように見える。ところが、Talin-1をノックダウンすると、細胞同士が接触した際に典型的なCILを示し遊走方向を反転するようになることがわかった。この結果は、CILには接着斑の柔軟性が重要であり、CILを起こす際には、接着斑が解離する必要があることを示している可能性がある。
LMO7のアクチン骨格の状態への関与や、接着斑のCILへの関与等、新たな視点を見出すことができており、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の結果を踏まえて、今後は以下のように研究を進めていく予定である。
(1)正常線維芽細胞のアクチン骨格におけるLMO7の役割を明らかにする。①正常線維芽細胞の遊走時におけるLMO7の挙動を、EGFP等を融合したタンパク質のライブ観察により調べる。②LMO7ノックダウン細胞の単独時およびコンフルエント時の遊走挙動をタイムラプス観察により詳細に解析する。③LMO7ノックダウン細胞のアクチン骨格、ミオシンIIアイソフォーム、微小管、接着斑の状態を解析する。④ミオシンIIBのノックダウン細胞のLMO7の局在や挙動を明らかにする。
(2) Talin-1および、もう一つのアイソフォームであるTalin-2の細胞遊走における役割を、特に、接着斑とCILとの関わりに注目して明らかする。①正常線維芽細胞の遊走時におけるTalin-1とTalin-2の局在や挙動を比較解析する。②これらのノックダウンによる接着斑の形成・成熟の程度をVinculinの局在や挙動を元に解析する。③これらのノックダウンがCILに及ぼす影響を、細胞の低密度および高密度状態でそれぞれ解析する。④同様にVinculinのノックダウンやVinculinの擬似リン酸化体等の発現がCILに及ぼす影響を解析し、接着斑の柔軟性とCILとの関連を検討する。
(3) 上記と同様の解析を、正常線維芽細胞と不死化線維芽細胞の混合培養条件で行い、コンフルエント時の正常線維芽細胞の挙動が正常線維芽細胞同士の細胞間の接触によるものなのかを検討する。
(4) 上記と同様の解析を、正常線維芽細胞の継代数の異なる細胞を用いて行い、細胞老化と方向持続的遊走の関連を検討することに着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
３種類の細胞株（約75,000円）を購入する予定だったが、新型コロナウイルスの影響等で次年度に持ち越した。また、予定していた北海道大学ニコンイメージングセンターにおける顕微鏡の使用料金が、長時間連続使用の特別割引を受けたことで、約50,000円残った。
３種類の細胞株は次年度が始まり次第、購入予定である。残りは、次年度のニコンイメージングセンターにおける顕微鏡の使用料金として使用する予定である。
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