| 研究課題/領域番号 |
18K06201
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
北村 朗 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (10580152)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RNA / タンパク質凝集体 / CD / FRAP / FCCS / RNA-タンパク質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
前年度に引き続き，生細胞内へビーズローディング法により導入した蛍光標識RNAの動態 を，Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)法を用いて解析した．前年度と行った実験とフォールドは同様であるが異なる配列のRNAを解析したところ，動的割合がほぼ100%という結果を得た．その配列により細胞内因子への結合性が異なる可能性が示唆された．
前年度及び今年度使用したRNAについて，二次構造を調べるために円偏向二色性 (CD)分光器を用いて測定を行ったところ，予想通りのフォールドを示すスペクトルが得られた．この結果は，RNAのフォールドに対して明確な証拠となるものであり，重要な基礎的検証結果が得られた．
次に，蛍光相互相関分光法 (FCCS)を用いて，ALS関連タンパク質であるTDP43のカルボキシル末端断片 (TDP43CTF)を発現させた細胞の抽出液と，蛍光標識RNAを混合し，相互作用を調べたところ，特異的な結合が見られた．このときTDP43CTFは，いわゆるRNA認識領域を持たない配列であるにもかかわらず，RNAとの結合が見られたことから，2016年に発表した論文で示唆したRNA結合可能性について，実データをもとに実証することができた．さらに，このRNAのフォールド状態を変化させるため，LiCl存在下でTDP43CTFと蛍光RNAとの相互作用を調べたところ，以前結合は観察されたことから，TDP43CTFはフォールドしていないRNAを認識している可能性が示された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FRAPの実験を継続して行い，CD分光法によるRNAフォールドの検証等，着実に進展している．ただし，実際のRNAによるシャペロン効果の実証に関する確証には至っておらず，研究全体としては概ね順調ではあるものの，予想以上の進展ではないと判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
蛍光相互相関分光法を用いてRNA-タンパク質間相互作用における両者間の解離定数の測定を行う．ただし，相互作用の強度はかなり弱い（現状の見積もりとしては数十マイクロモーラー以上の値）と推定しており，測定条件の改善にも着手する．さらに，RNAによるシャペロン効果の実証のため，実際の細胞内でRNAを発現させ，凝集形成抑制を判定する研究を推進したい．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本来は2019年度の二月から三月にかけて実施予定であった課題のために用いる予定であったが，2019年度で終了予定であった別科研費課題の研究遂行に時間を要し，三月までに実施できなかった．
ただし，年度が明けてすぐにその研究のために必要な消耗品・器具を購入してすでに実施開始済みである．また前年度の末に使用予定であったものが二ヶ月先延ばしになっただけであり，三カ年の研究計画としての変更点はない．
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