神経変性疾患に関連したタンパク質凝集形成を防ぐシャペロンRNAの実証

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06201
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 北村 朗 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (10580152)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: RNA / タンパク質凝集体 / ALS / TDP-43 / 蛍光相関分光法 / 線虫

研究実績の概要

TDP-43CTFが認識するRNAのフォールド状態の変化を確かめるために，種々のカチオンを添加した条件で両者の相互作用を，蛍光相互相関分光法 (FCCS)を用いて解析した．緑色蛍光タンパク質GFPで標識したTDP-43CTFを発現するマウス神経芽細胞種Neuro2a細胞の細胞破砕液を用意し，種々のカチオン存在下でRNAと混合してFCCS解析を行った．結果，TDP-43CTFが明確なRNAフォールドを認識しているのではなく，フォールドの中で露出する部分的な配列を認識している可能性が示唆された．また，TDP-43CTFとRNAの相互作用に必要なドメインを，欠損変異体を用いたFCCS解析により確かめた．さらに，Neuro2a細胞にRNAを発現させることでTDP-43CTFの不溶性画分を減らせることが分かった．これらのことは，培養細胞を用いたRNAのシャペロン機能実証においてきわめて重要な証拠であると考える．
線虫における凝集抑制効果を確かめる系を確立するため，feeding法によりRNAを発現する大腸菌を線虫に食べさせ，その取り込んだRNAが機能することを確かめるために，RNAiの効率で判定を行ったところ，目的遺伝子のノックダウンがqPCRおよびウェスタンブロットにより確認できた．このことから，RNAを線虫内に取り込ませる系が確立できた．
さらに，TDP-43CTFを筋肉に発現する線虫の寿命解析を行い，コントロールと比べて有意に寿命が短くなることが示された．このことき，TDP-43CTFが毒性を持ち，寿命短縮に影響するものと考える．

研究成果

• [国際共同研究] Tata Institute of Fundamental Research(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: Tata Institute of Fundamental Research
• [雑誌論文] ALSにおけるTDP-43タンパク質凝集体形成と遺伝子治療 (2021)
  • 著者名/発表者名: 北村朗
  • 雑誌名: Bio Clinica 巻: 36 ページ: 453-456
• [雑誌論文] Detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kitamura Akira, Fujimoto Ai, Kinjo Masakata
  • 雑誌名: Journal of Visualized Experiments 巻: 170 ページ: e62576
  • DOI: 10.3791/62576
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of the triplet-state kinetics of a photosensitizer for photoimmunotherapy by fluorescence correlation spectroscopy (2021)
  • 著者名/発表者名: Takakura Hideo、Goto Yuto、Kitamura Akira、Yoshihara Toshitada、Tobita Seiji、Kinjo Masataka、Ogawa Mikako
  • 雑誌名: Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 巻: 408 ページ: 113094～113094
  • DOI: 10.1016/j.jphotochem.2020.113094
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular basis of functional exchangeability between ezrin and other actin-membrane associated proteins during cytokinesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Yang Guang、Hiruma Shota、Kitamura Akira、Kinjo Masataka、Mishra Mithilesh、Uehara Ryota
  • 雑誌名: Experimental Cell Research 巻: 403 ページ: 112600～112600
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2021.112600
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Spatial Image Correlation Spectroscopy (ICS): A Technique for Average Size Determination of Subcellular Accumulated Structures from Fluorescence Microscopic Images (2020)
  • 著者名/発表者名: Kitamura Akira, Kinjo Masakata
  • 雑誌名: BIO-PROTOCOL 巻: 10 ページ: e3624
  • DOI: 10.21769/BioProtoc.3624
  • 査読あり
• [雑誌論文] ALSにおけるタンパク質凝集体と遺伝子治療 (2020)
  • 著者名/発表者名: 北村朗
  • 雑誌名: メディカル・サイエンス・ダイジェスト (MSD) 巻: 46 ページ: 763-765
• [雑誌論文] Membrane Surface Modulates Slow Diffusion in Small Crowded Droplets (2020)
  • 著者名/発表者名: Harusawa Kanae、Watanabe Chiho、Kobori Yuta、Tomita Kazuho、Kitamura Akira、Kinjo Masataka、Yanagisawa Miho
  • 雑誌名: Langmuir 巻: 37 ページ: 437～444
  • DOI: 10.1021/acs.langmuir.0c03086
  • 査読あり
• [学会発表] Interaction analysis of aggregate-prone protein TDP25 and RNA in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) (2021)
  • 著者名/発表者名: 藤本 愛, 金城 政孝, 北村 朗
  • 学会等名: 北大細胞生物研究集会
• [学会発表] Lifespan and motility analysis of C. elegans expressing C-terminal fragments of ALS-causative TDP-43 (2021)
  • 著者名/発表者名: Yidan Lyu, Rei Kawashima, Renee; Brielman, Richard I. Morimoto, Masataka Kinjo, Akira Kitamura
  • 学会等名: RIKEN BDP Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Aggregation process of carboxyl terminal fragments of TDP-43 protein (2020)
  • 著者名/発表者名: Akira Kitamura, Masataka Kinjo
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Laboratory 2020 Meeting "Protein homeostasis in Health & Disease"
  • 国際学会
• [学会発表] 蛍光相関分光法による蛍光分子光物理反応速度定数の同定 -新規免疫治療薬剤の定量的開発指針の確立に向けて- (2020)
  • 著者名/発表者名: 北村朗，高倉栄男，後藤悠人，金城政孝，小川美香子
  • 学会等名: 2020年度・光イメージン若手の会「光塾」