中心体を起点とした細胞膜形成の分子メカニズム

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06225
• 研究機関: 大阪市立大学
• 研究代表者: 中村 太郎 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (30291082)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 中心体 / 酵母 / 膜 / Rab

研究実績の概要

「微小管の形成中心」としての中心体のはたらきについては世界的に盛んに研究されてきた。一方で、中心体は「細胞膜の形成起点」としてもはたらいているが、微小管形成に関する役割に比べて研究例も少なく、その分子メカニズムは不明な点が多い。分裂酵母の胞子細胞膜の形成は、中心体（酵母ではスピンドル極体SPBとよばれる）から始まる。本研究の最終目的は、分裂酵母の胞子細胞膜形成の中で特にSPBにおける膜形成開始に焦点を当て、形成に必要な遺伝子の同定と解析により、その分子メカニズムを解明することである。電子顕微鏡による観察で、胞子形成時にはSPBの細胞質側にMOP (meiotic outer plaque)という層状の構造が形成されることがわかっている。これまで、申請者らはMOPを構成するタンパク質を数個明らかにしてきた。しかしながら、これらをSPBにつなぐしくみはわかっていなかった。本研究ではゲノムワイドな逆遺伝学と生化学的手法を組み合わせ、このしくみ解明を目指す。本年度はMOP構成因子をSPBに局在させる因子Dms1を同定し、その性格付けを行った。その結果、Dms1は胞子細胞膜形成開始に必須であった。また、栄養増殖時から胞子形成時を通して、SPBに局在することがわかった。さまざまな欠失変異株を再生し、解析した結果、Dms1はそのC末端にある膜貫通ドメインで核膜に局在し、N末端側でMOP構成因子と相互作用し、これらの因子をSPBに局在させることがわかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

分裂酵母では非必須遺伝子約3,500の遺伝子破壊株セットが作製されている。この株のうちで胞子細胞膜形成に欠損がみられるものを網羅的に解析し、Dms1を同定した。Dms1は膜貫通ドメインを持つ機能未知のタンパク質であった。dms1破壊株で胞子細胞膜は全く形成されなかったことから、Dms1は胞子細胞膜形成開始に必須であることがわかった。Dms1にGFPを付加し、その局在を観察した結果、栄養増殖時からSPBに観察された。また、核膜にも弱いながらシグナルが見られた。MOP構成因子であるSpo15, Spo2, Spo13はdms1の遺伝子破壊株ではいずれもSPBに観察出来なかった。逆にspo15, spo2, spo13の遺伝子破壊株ではDms1は SPBに局在できた。Dms1のC末端にある膜貫通ドメインを削った変異タンパク質はSPBに局在できなかった。逆に膜貫通ドメインだけでもSPBに局在することができた。以上のことから、Dms1は膜貫通ドメインを介して核膜に局在し、N末端側でMOP構成因子と相互作用し、これらをSPBにとどめている可能性が示唆された。

今後の研究の推進方策

１，Dms1とMOPをつなぐタンパク質の同定：今回の解析ではDms1と既存のMOP構成因子との直接的な結合は見られなかったため、Dms1は未知のタンパク質を介してMOPをSPBに局在させていると考えられる。そのタンパク質を分子遺伝学的手法や生化学的手法により取得する。
２：MOPの活性化メカニズムの解明：胞子細胞膜形成がSPB上で開始するためにはMOPが活性化する必要がある。Ypt2は、低分子量GTPaseのRab8のオルソログであり、その候補因子の１つである。Spo13は、Ypt2のSPBへの局在に必要であるが、同時にRabタンパク質の活性化のためのGEF活性も有している。しかしながら、Spo13のGEF活性をなくしても胞子細胞膜形成はある程度できることから、申請者はYpt2のもう１つのGEFであると考えられるSec2（高等生物のRabin8のオルソログ）に注目している。Rabin8は高等生物ではリン酸化などにより高度に調節されている。Sec2はSPBに局在するなど胞子形成に関わる可能性が高いが、生育に必須な遺伝子であるため、いまだ詳細な機能はわかっていない。そこで本研究では、i)sec2+遺伝子にランダムに変異を導入し、胞子形成に欠損を示す突然変異株を取得する　ii)取得した変異株の形質を詳細に解析する。iii)Sec2と他のSPBタンパク質との相互作用、およびin vivo, in vitroでSec2によるYpt2の活性化の解析を行う。

次年度使用額が生じた理由

分子生物学関連の試薬が予想よりも少なくすんだため、その予算を来年度分とした。

研究成果

• [雑誌論文] The fission yeast SPB component Dms1 is required to initiate forespore membrane formation and maintain meiotic SPB components. (2018)
  • 著者名/発表者名: Touko Niimi and Taro Nakamura
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 13 ページ: e0197879
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0197879. eCollection 2018.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 分裂酵母の胞子形成過程に関わる生育に必須な遺伝子の取得と解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三浦 悠、中村 太郎（大阪市大・院理）
  • 学会等名: 第36回YEAST WORKSHOP
• [学会発表] 分裂酵母の胞子はどのように形成されるか？ (2018)
  • 著者名/発表者名: 新美 柊子、中村 太郎（大阪市大・院理）
  • 学会等名: 第36回YEAST WORKSHOP
• [学会発表] 分裂酵母の胞子形成過程に関わる生育に必須な遺伝子の同定および解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三浦 悠、中村 太郎（大阪市大・院理）
  • 学会等名: 酵母遺伝学フォーラム 第51会研究報告会
• [学会発表] 分裂酵母のSPBタンパク質Spo15の胞子形成における機能の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 新美 柊子、中村 太郎（大阪市大・院理）
  • 学会等名: 酵母遺伝学フォーラム 第51会研究報告会
• [備考] 大阪市立大学大学院理学研究科細胞機能学研究室
  • URL: http://www.sci.osaka-cu.ac.jp/biol/cbiol/pombe/pombe_J.htm