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2020 年度 実施状況報告書

GPCRの細胞内輸送による活性調節機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 18K06229
研究機関東京工科大学

研究代表者

十島 純子  東京工科大学, 医療保健学部, 教授 (00431552)

研究分担者 十島 二朗  東京理科大学, 基礎工学部生物工学科, 教授 (00333831)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2022-03-31
キーワードエンドサイトーシス / GPCR / 細胞内輸送
研究実績の概要

研究課題 (1) GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、については、ゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響や、アクチン重合に及ぼす影響について、PtdIns(4)Pの脱リン酸化酵素であるSac1やInp51/52/53pの変異体を用いて解析する予定であったが、現在まだ変異体株の作成中であり、解析は進んでいない。研究課題 (2) 細胞内へと取り込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、については、前年度の研究に引き続き、Pan1p(哺乳類 Eps15ホモログ)をプローブとしたラパマイシン誘導性二量体化法によりクラスリン小胞-アクチン骨格間の結合に関わる因子の解析を進めた。本年度はPan1pを異所性に発現させた際のクラスリンコートタンパク質やアクチン制御因子の動態を解析するために、これらを発現する細胞株を作成した。今後これらの細胞株を用いて解析を行う。また、Pan1p やその結合タンパク質のアクチン結合ドメインの欠損体がアクチン重合やエンドサイトーシスに及ぼす影響については解析を行い、Pan1pに加えEnt1p, Ent2pがこれらの過程に必要であることを明らかにした。研究課題(3) GPCR輸送におけるゴルジ体―エンドソーム-リソソーム間の輸送経路の解明については、クラスリン小胞がエンドサイトーシス経路を輸送される際、ゴルジ体がどのような役割を果たしているか解析した。本年度の研究では、蛍光エンドサイトーシスマーカがトランスゴルジ網(TGN)に局在するt-SNARE画分に取り込まれ、その後Rab5の局在するエンドソームと融合することを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は様々な生理活性物質をリガンドとする細胞膜上受容体であり、創薬の主要な標的として重要な分子である。GPCRは特異的なリガンド分子の結合より活性化されるが、その不活性化はエンドサイトーシスによる細胞膜からの排除により制御されている。以前の研究で研究代表者らは、活性化したGPCRを特異的に標識する新しい蛍光GPCRマーカーの開発に成功し、そのマーカーを用いたエンドサイトーシス関連遺伝子の網羅的なスクリーニングを行なった。本研究は、スクリーニングにより得られた変異体の詳細な解析を通して、GPCRのエンドサイトーシス機構の全容を明らかにすることを目的とし、(1) GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、(2)細胞内へと取込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、(3)GPCR輸送におけるゴルジ体-エンドソーム-リソソーム間の輸送制御機構の解明、の3つのプロジェクを実施している。
本年度はcovid-19の感染拡大に伴い、学内での研究が厳しく制限されたこため、この間に計画していた実験がすべて延期となってしまった。これにより、研究の進捗は当初の計画よりも遅れている。よって、研究期間を延長し引き続き研究を実施する。

今後の研究の推進方策

研究課題(1)についてはゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響について、Sac1pやInp51/52/53pの変異体に加え、フリッパーゼ(P4-ATPase)の変異体を作成し、これらの影響を解析する。研究課題(2)については昨年度作成した細胞株を用いて、ラパマイシン誘導性二量体化法によりPan1pを異所性に発現した際のクラスリンコートタンパク質やアクチン制御因子の動態を解析する。研究課題 (3)については、クラスリン小胞がエンドサイトーシス経路を輸送される際にゴルジ体を経由する意義について、リサイクルに対する影響を調べる。具体的には、TGNから細胞膜へリサイクルされるSnc1p (v-SNAREタンパク質)やFM4-64(蛍光脂質膜マーカ-)の局在を野生型とGGAs(ゴルジ体局在のクラスリンアダプタータンパク質)欠損体で比較する。

次年度使用額が生じた理由

本年度は、緊急事態制限発令のため研究が制限された影響で、この間に計画していた実験がすべて延期となってしまった。これに伴い、いくつかの試薬について購入し直す必要がある。次年度使用金(57,558円)はこれら試薬の購入に充てる予定である。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2020

すべて 学会発表 (11件)

  • [学会発表] ゴルジ体における糖鎖修飾抑制のエンドサイトーシスに与える影響2020

    • 著者名/発表者名
      大森唯史, 島村洋輝, 長野 真, 十島 純子, 十島 二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] 出芽酵母におけるゴルジ局在Rab11およびPI4キナーゼを介したRab5局在エンドソーム形成機構2020

    • 著者名/発表者名
      長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] アクチン結合タンパク質Abp1pのクラスリン仲介型エンドサイトーシスにおける役割2020

    • 著者名/発表者名
      国広真弓, 長岡稜夏, 小倉一萌, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] 塩基性両親媒性薬剤の細胞内小胞輸送経路に与える影響2020

    • 著者名/発表者名
      山田啓史, 野﨑龍, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] エンドサイトーシス経路におけるPI(4)Pホスファターゼの必要性2020

    • 著者名/発表者名
      加々美瑠衣, 諏訪園真大, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] ゴルジ体PI4キナーゼPik1pによるポストゴルジ体輸送経路を介したエンドサイトーシス経路の制御2020

    • 著者名/発表者名
      福田駿介, 青嶋海斗, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] 出芽酵母Rab6ホモログYpt6pのエンドサイトーシスーリサイクリング経路における役割2020

    • 著者名/発表者名
      渡辺瞳, 野間悠加, 佐藤匠, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第94回日本生化学会大会
  • [学会発表] エンドソーム形成におけるゴルジ体局在性のクラスリンアダプターの役割2020

    • 著者名/発表者名
      長野真, 青嶋海斗, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第53回酵フォーラム研究報告会
  • [学会発表] クラスリン仲介型エンドサイトーシスにおける小胞体-細胞膜接触部位でのPI(4)P調節の必要性2020

    • 著者名/発表者名
      佐野智紀, 和田卓, 山本航, 長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第43回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] ゴルジ体でのPI(4)Pレベルの調節はRab5を介したエンドソーム輸送に必要である2020

    • 著者名/発表者名
      福田駿介, 青嶋海斗, 佐野智紀, 長野 真, 十島 純子, 十島 二朗
    • 学会等名
      第43回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] 出芽酵母におけるトランスゴルジネットワーク上でのRab5 GTPase活性化の分子機構2020

    • 著者名/発表者名
      長野真, 十島純子, 十島二朗
    • 学会等名
      第43回日本分子生物学会年会

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公開日: 2021-12-27  

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