Importinβファミリー核－細胞質間輸送因子の調節による細胞制御機構の解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06235
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 木村 誠 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (00290891)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 核輸送 / importin / 細胞分化

研究実績の概要

高等動物に約20種類存在するimportinβファミリー蛋白質は核－細胞質間輸送因子であり、分担して数千種の蛋白質を核内外へ輸送する。一つの輸送因子の輸送基質蛋白質群は関連のある細胞内プロセスに関わることが示唆されており、それぞれの輸送因子の発現量や活性の調節を介した核蛋白質の選択的輸送が細胞活動の制御に関わると予想される。現在、importinβファミリー輸送因子の特異的基質の大規模同定の結果が次々と報告されており、その知見を利用できる好機を捉え、多数の特定された蛋白質の核輸送調節による細胞制御機構の研究を開始した。
細胞の変化に伴う輸送因子の発現調節と基質蛋白質核移行について解析可能な実験系を構築するため、老化（セネッセンス）、神経分化、筋分化、血球分化などの誘導が可能なヒト、マウス、ラットの７種類の培養細胞で、それらの過程における輸送因子の発現量の解析を行った。解析にはウェスタンブロット法を用い、特異的抗体の入手が可能な18種類のimportinβファミリー輸送因子に加え、ファミリー中でimportinβのみが基質結合のアダプターとする６種類のimportinαファミリー蛋白質、輸送サイクルの駆動に関与する数種類の蛋白質の継時的な発現量を調べた。
importinαファミリー、importinβファミリーとも誘導過程により異なる少数の因子で発現変動が見られた。また、importinβファミリーでは、主に微量な因子の発現変動が認められた。これらは、従来の個別の因子に注目した実験では看過されてきた輸送因子発現レベル変動の一般的傾向であると言える。この結果に基づいて、基質蛋白質の核移行に注目した細胞制御の解析に進む予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の目的は、大規模基質同定で得られた情報を利用して、培養細胞で輸送調節が確認される現象を例に、機能の異なる一群の蛋白質の核局在変化と協働による細胞制御機構の最初の解析を行うことであり、その方法論を他に先駆けて確立する必要がある。そのためには実験系の選定が肝要であるが、実際に様々な培養細胞分化誘導系でほぼ全てのimportinファミリーと関連因子の蛋白質レベルでの信頼性の高い継時的発現変動データを得たことで、必要な性質を満たす実験系を確立できる可能性が高まったと言える。

今後の研究の推進方策

30年度に解析した培養細胞に加え、マウス杯幹細胞でも同様の輸送因子の発現解析を行い、次段階での解析対象となる少数の誘導系を決定する。輸送因子発現変動の解析結果と大規模基質同定で報告される情報から、核局在の変化が予想される蛋白質を選定し細胞の抗体染色で確認する。同時に、核内蛋白質のプロテオミクス解析により、輸送因子調節に伴う蛋白質核局在変化を検証する。その後、発現操作と顕微鏡観察を含む細胞生物学的解析、生化学・分子生物学的な核内反応解析、網羅的発現解析など、注目する蛋白質群に応じた方法で基質蛋白質の機能的相互作用を解析する。

次年度使用額が生じた理由

当初計画では、30年度の輸送因子発現量の解析で発現変動の認められた輸送因子の代表的な既知の基質蛋白質の核移行について随時確認しながら、様々な培養細胞誘導系の解析を進める予定であった。しかし実際には、作業効率の観点から、輸送因子の発現変動のみを予定した全ての培養細胞誘導系で先に解析した後、細胞を絞って、既知基質の核移行を解析することとした。したがって、30年度に購入予定の既知基質特異的抗体が未購入となり、これを次年度以降に購入する予定である。同様に、核内蛋白質のプロテオミクス解析も、解析対象細胞を絞ってから行うこととし、安定同位体培地の購入を次年度以降に繰り越した。その他は概ね当初計画に従う予定である。