| 研究課題/領域番号 |
18K06235
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
木村 誠 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (00290891)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 核輸送 / importin / 細胞分化 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物の細胞では数千種の蛋白質が必要に応じて核－細胞質間を移動する。この移動の多くはimportinβファミリー核－細胞質間輸送因子に媒介され、ヒトで20種類存在する同因子は、それぞれ一群の蛋白質を特異的な輸送基質として分担輸送する。ファミリーのうちimportinβのみは数種類のimportinαファミリー蛋白質を結合アダプターとしてより多群の蛋白質を輸送する。一つの輸送因子の基質蛋白質群には共通の細胞内プロセスに関わるものが多く含まれることが報告され、様々な細胞活動の制御の過程では、個々の輸送因子の発現量や活性の調節により蛋白質が選択的に輸送されると予想できる。輸送因子特異的基質の大規模同定の結果が次々と報告される好機を捉え、多数の蛋白質の核輸送調節による細胞制御機構の研究を進めている。
本研究に適した実験系を構築するため、老化（セネッセンス）、神経分化、筋分化、血球分化などの誘導が可能なヒト、マウス、ラットの７種類の培養細胞で、ウェスタンブロット法により、各過程における19種類のimportinβファミリー輸送因子、６種類のimportinαファミリー蛋白質、輸送サイクル駆動に関与する５種類の蛋白質の発現量の解析を行った。importinαファミリー、βファミリーとも誘導過程により異なる少数の因子で発現変動が見られ、βファミリーでは主に微量な因子の発現変動が認められた。これは、従来の個別的な研究では見落とされた輸送因子発現レベル変動の一般的傾向であると言える。発現変動が顕著な細胞から分化誘導前後の核蛋白質を分離し電気泳動法等で比較解析した結果、その蛋白質成分に相当の差異があることが予想された。今後は、質量分析法による核蛋白質の比較定量を用いて、輸送調節に注目した細胞制御機構の解析に進む予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的は、細胞活動における核－細胞質間輸送調節の重要性を示すことである。そのため、細胞の生理的変化に大きく関与する輸送調節の例を見出し、それにより核局在が変化する一群の蛋白質の特定の後、それらの蛋白質の協働により細胞活動が進行する過程を解明することを目指す。輸送調節を起点とし、多数の特定された輸送基質蛋白質を対象とした細胞制御機構の解析には前例がなく、まずその方法論を他に先駆けて確立する必要がある。それには有利な実験系の構築が肝要であるが、実際に様々な培養細胞分化誘導系でimportinファミリーと関連因子の信頼性の高い蛋白質レベルでの継時的発現変動データを取得し、その発現変動が顕著な細胞分化系では核蛋白質の相当の変動が予想されたため、今後の解析の目処が立ったと言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
顕著な輸送因子発現変動が確認された培養細胞分化誘導系で、分化に伴う核蛋白質の変動を定量的質量分析法で解析して、核局在変化の著しい蛋白質を特定する。既存の大規模基質同定実験の結果を参照して、それらの蛋白質の輸送を分担する輸送因子を特定する。ここで、輸送因子未確定のものについては、組換え蛋白質を用いた結合実験で特異的輸送因子を決定する。また、発現変動の大きい輸送因子の既知の基質でありながら質量分析実験で同定・定量されなかった蛋白質は、細胞の抗体染色法で分化に伴う局在変化を確認する。その後、輸送因子の発現抑制・過剰発現実験を行い、これら基質蛋白質の局在変化、また、細胞分化過程への影響を解析する。さらに、基質蛋白質の機能的相互作用について、発現操作と顕微鏡観察を含む細胞生物学的解析、生化学・分子生物学的な核内反応解析、網羅的発現解析など、注目する蛋白質群に応じた方法で解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画では、分化誘導中に発現変動の認められた輸送因子の代表的な既知の基質蛋白質の細胞内局在について、細胞の抗体染色法で随時確認しながら、様々な培養細胞誘導系の解析を進める予定であった。しかし実際には、作業効率の観点から、輸送因子の発現変動のみを予定した全ての培養細胞誘導系で先に解析した後、細胞を絞って研究を進めることとした。また、そこで実際に絞り込んだ細胞分化系の特性として、核蛋白質の分離方法の検討が必要であると判明したため、質量分析法による核蛋白質変動の網羅的解析の前に、その検討を行うこととした。文献情報によりこの分化系で核局在変化の予想される蛋白質が見つかったため、その蛋白質の各局在変化をウェスタンブロット法などの容易な方法で確認しながら、核蛋白質分離法を検討することとした。以上の変更により、未購入となった細胞染色用の抗体の購入、先送りされた質量分析に必要な試薬購入・分析依託が最終年度に繰り越された。
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