| 研究課題/領域番号 |
18K06236
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小野 弥子 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (20392376)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | プロテアーゼ / 相互作用タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
カルパイン7のプロテアーゼ活性検出が可能な系、及び、新規結合タンパク質の同定を目的として、以下を実施した。
1) 従来用いてきた培養細胞の系、及びin vitro発現系において全長と共に各種の欠失変異体を発現させ、発現タンパク質の安定性を検討し、活性測定を試みた。いずれの場合も、発現量は確保できたが未精製状態では汎用されているカルパイン基質ペプチドなどに対する明らかな活性は検出されなかった。
2) 報告されているCAPN7の結合タンパク質IST1を内在性のコントロールとし、BioIDによる結合タンパク質検索の条件検討を行った。これまでに、全長タンパク質をbaitとしたスクリーニングを複数回行い、培養条件と同定条件の検討を行った。IST1より優位に検出され再現性があるものが複数得られたため、今後の解析対象として発現コンストラクトの作製に取りかかった。上記で作製した欠失変異体を用いて、CAPN7とこれらの候補タンパク質とが近隣に局在するために必要な領域および、細胞内での局在を同定する予定である。これらのタンパク質群が帰属するGOについても検討する。
また、他のカルパインについての報告を参考に、CAPN7分子間・分子内での相互作用の可能性を複数の方法で検討したが、有意な結果は得られなかった。次年度以降トランスジェニックマウス組織からのCAPN7精製を行い、その標品についての結果と比較する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
プロテアーゼ活性が検出できないことについて、有効な対策が見つけられなかった。また、BioIDでのスクリーニングについて測定結果を精査する条件を決めるまでに時間がかかってしまい、各ドメインに分けたスクリーニングについて準備が遅れている。そのため、既報のCAPN7相互作用因子や基質候補タンパク質に関する情報との整合性について考察する段階に至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
発現が可能であると確認できたコンストラクトについては、一通りの精製を行いその過程での挙動を調べる。また、現在作製しているコンストラクトについては、特に細胞内での局在を特定することを優先して行う。当初の計画通り、共発現によりCAPN7の活性を増強する分子を見いだすことと合わせて、同等の影響を及ぼす生理的な刺激を検討する。そのために、野生型と活性欠失型の比較を培養細胞で行うだけでなく、トランスジェニックマウスの組織におけるプロテオームを解析対象に加える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は本研究費を使用すべき学会参加がなかったこと、実施した実験の規模が予定より小さかったため、物品費の支出額が減少したこと、が原因である。これらは主に次年度の学会出張費として使用する計画である。
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