| 研究課題/領域番号 |
18K06242
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
弥益 恭 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60230439)
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| 研究分担者 |
津田 佐知子 埼玉大学, 研究機構, 助教 (80736786)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ゼブラフィッシュ / 多分化能幹細胞 / 尾芽 / 体軸伸長 / 神経管形成 / 神経発生 / Oct4型POU転写因子 / pou5f3 |
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| 研究実績の概要 |
・ゼブラフィッシュ胚の尾芽、そして胚軸後端部におけるOct4型転写因子pou5f3の発現の詳細を、体節形成の様々な時期において検討した。具体的には、尾芽幹細胞のマーカーとされるtbxta、神経管後端マーカーnkx1.2、沿軸中胚葉マーカーtbx6、神経発生遺伝子soxB1、主要シグナル遺伝子fgf8aとwnt3aなど、様々な尾芽領域形成遺伝子の発現と、2色FISH技術を用いて比較した。同時に、尾芽周辺領域の細胞構成を透過型電子顕微鏡により検討した。以上により、尾芽及び神経管後端の分子的、形態的構造を明らかにするとともに、pou5f3が尾芽幹細胞から神経細胞への移行に関与することを示唆した。
・pou5f3の加温誘導性ドミナントネガティブ遺伝子（hsp-en-pou5f3）をゲノム中に持つ遺伝子導入魚を用い、体軸伸長中の胚において、加温誘導によりpou5f3の機能阻害を行った。また、CRISPR/Cas9技術によりpou5f3の変異体を作成した。これらの胚で見られた表現型の解析により、尾芽形成と体軸伸長が神経形成遺伝子及びシグナル遺伝子pou5f3の制御下にあることを示した。
・各種シグナル阻害因子で処理した胚の尾芽においてpou5f3及び各種神経発生遺伝子、尾芽遺伝子の発現を検討し、pou5f3を初めとする尾芽関連遺伝子の発現がFGF、Wnt、そしてBMPシグナルにより制御されていることを示した。
・尾芽形成と脊髄発生におけるsoxB1の役割を検討するため、ゼブラフィッシュにおいてsox3とsox19aの遺伝子破壊を行い、系統化した。また、神経管でsox3及びpou5f3を発現する細胞の発生過程における動態を明らかにするため、CRISPR/Cas9技術を活用し、各遺伝子上流へのegfpレポーター遺伝子の相同組換え非依存的ノックイン実験に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
・尾芽形成及び神経管後端の伸長に関するこれまでの研究で、tbxta、wnt、fgf8、nkx1.2、soxB1などの関与が予想されていたが、これらの遺伝子の発現する尾芽周辺領域とpou5f3発現領域の位置関係を明らかにした。その結果、尾芽幹細胞から神経細胞への運命選択にpou5f3が関与することを示唆された。また、電子顕微鏡観察により、尾芽周辺における細胞構成が複雑であり、多様な細胞集団を含むことを確認した。これらの結果は、今後の尾芽形成、脊髄形成に関わる細胞群と遺伝子を解明するための基盤となる。
・ゲノム編集技術により新たにpou5f3、sox3、sox19aの変異体の作出に成功した。これらの変異体魚、そして既に保有する誘導性ドミナントネガティブpou5f3遺伝子導入魚を利用したLoss-of-Function実験を実行することで、pou5f3、そしてsoxB1が、予想されるように各種尾芽関連遺伝子及び神経発生遺伝子の発現制御を行っていることが確認された。これらの実験系は今後の研究でも大きな武器になると考える。
・尾芽形成を制御するとされるFGF、Wnt、BMPシグナルが、現在注目している遺伝子群の発現制御に関わることが確認された。今後、これらの各種シグナルの尾芽形成、脊髄発生における役割について、さらなる検討が可能となった。
・pou5f3発現細胞の蛍光標識を行うための相同組換え非依存的遺伝子ノックイン技術を導入した。今後、この技術を利用することで、尾芽周辺の特定領域に分布する細胞の蛍光標識とその追跡が可能になる。この技術をさらにGIFM法に発展させ、尾芽周辺での細胞の動態について、イメージング技術を活用出来ると期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
・すでに解析中のpou5f3変異体、そして新たに作製したsoxB１変異体を用い、pou5f3、soxB1の欠損した胚における尾芽形成、脊髄発生について、各種遺伝子マーカーを利用した遺伝子解析、電子顕微鏡での微細構造解析などにより検討する。また、soxB1については、ドミナントネガティブsox3遺伝子誘導の尾芽発生への影響を検討する。これらにより、尾芽の形成と維持、脊髄発生と神経形成におけるpou5f3、soxB1を中心とした遺伝子機構を理解する。
・現在進行中の相同組換え非依存的ノックイン法を用いたpou5f3、sox3発現細胞の蛍光標識を完成した上、これらの遺伝子発現、そして発現細胞の尾芽発生、脊髄伸長における動態の追跡を行う。さらに、pou5f3、sox3の上流に対するCreERT2遺伝子のノックインを行う一方（pou5f3:CreERT2、sox3:CreERT2）、Cre-LoxP系によりtamoxifen依存的に蛍光タンパク質ZsGreen標識が可能な遺伝子導入魚を作成する（CAG-loxP-Stop-loxP:ZsGreen）。これらの遺伝子導入魚を用い、pou5f3、sox3を発現する細胞の永久標識、そして発生後期、成体におけるこれら発現細胞の動態追跡を可能にする（GIFM法）。さらに、尾芽幹細胞のマーカーとされるtbxtaを発現する細胞のGIFM法による追跡を行うための準備（tbxta細胞のCreERT2標識など）にも着手する。
・尾芽幹細胞から脊髄後端への移動と神経前駆細胞への分化、神経前駆細胞から脊髄細胞への成熟の2つの過程各々について、tbxta、pou5f3、soxB1各々の役割、これらの遺伝子の相互作用について、各遺伝子の強制発現、機能阻害、そして転写制御に関わるプロモーター解析などにより検討を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、2018年6月に米国ウィスコンシン州マディソンで開催される国際ゼブラフィッシュ学会に参加を予定していたが、当時務めていた学科長、コース長の職務との兼ね合いで海外出張が困難となり、研究発表を国内学会（小型魚類研究会、日本発生生物学会、日本分子生物学会）のみとしたことが最大の原因である。第２に、予定していたRNA-Seq解析の準備が間に合わず、2019年度に持ち越しになったことがある。ただし、これは大きな遅れではなく、準備でき次第、着手する予定であり、スケジュールの変更ではない。
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