| 研究課題/領域番号 |
18K06248
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
篠村 多摩之 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (70206118)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 軟骨細胞 / II型コラーゲン / アグリカン / 転写制御 / エンハンサー / エピゲノム修飾 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、軟骨基質の主成分であるII型コラーゲン及びアグリカンの遺伝子発現制御のメカニズムを明らかにし、その上で両遺伝子の発現を制御するための新たな手法を見つけ出すことである。そこで初年度はまず、我々がこれまでに明らかにしてきたII型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子上の複数のエンハンサーエレメントに着目し、それらの機能的な差異を明らかにし、その上でそうした差異が生まれる分子的な背景について解析を進めた。
幾つかの予備実験を通して、それぞれのエンハンサーはヒストンのアセチル化によってその活性が制御されていることが分かった。そこでどのような因子がどのようなメカニズムで遺伝子発現の制御に関わっているのかを具体的に明らかにするために、II型コラーゲン遺伝子の発現制御に焦点を絞り、エンハンサー領域におけるヒストンのアセチル化と遺伝子発現の関係について解析を進めた。その結果、以下の２点が明らかになった。
① II型コラーゲンの２つのエンハンサー (E1 と E2)は、２種類のヒストンデアセチラーゼ （ HDAC10 および Sirtuin 6 ）によってその活性が調節されている。
②Sirtuin 6 は、両エンハンサー (E1 と E2) 領域に結合しているヒストンタンパク質の脱アセチル化を介して、遺伝子発現を負に制御している。一方、HDAC10 は 一方のエンハンサー (E2) 領域にのみ作用して遺伝子発現を制御していることが明らかになった。
以上の結果は、加齢に伴う遺伝子発現の低下を解析していく上で、今後非常に重要な意味を持つものと考えられる。またヒストンデアセチラーゼには DNA 結合性は見られないので、それぞれのエンハンサーの特性は、特異的に結合している転写因子を介して決められていることが強く示唆された。この点は今後の研究にとって非常に重要な点である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究に於いては、まずはII型コラーゲンおよびアグリカンの転写に関わる複数のエンハンサーが、機能的に異なっているかどうかを明らかにする必要があった。そこでこの点については、これまでの様々な研究から、軟骨細胞の代謝と深い関わりがあるとされてきたホルモンおよび増殖因子に着目し、それらが異なったエンハンサーエレメントを介してII型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子発現に影響を及ぼすかどうか解析することから始めた。更に、特異的な阻害剤が多数利用可能なエピゲノム修飾についても、それぞれのエンハンサー活性と阻害剤との関連性について解析を進めた。その結果、それぞれの遺伝子発現は、それぞれ異なったエンハンサーを介して様々に制御されていることが確認できた。
以上の結果から、各エンハンサーは機能的に異なっていることが分かったので、次に各エンハンサーエレメントの機能に差異が生じる分子的な背景を明らかにするために、II型コラーゲンの遺伝子に焦点を絞り、それぞれのエンハンサー領域におけるヒストンのアセチル化と遺伝子発現との間の相関性について解析を進めた。その結果、脱アセチル化酵素、HDAC10 および Sirtuin 6 の特異的な関与を明らかにすることができた。
以上の結果を踏まえ、研究は概ね順調に進んでいる。なお、今回明らかになったエンハンサーのエピゲノム修飾については、ヒストンのアセチル化以外にも、DNAのメチル化、ヒストンのリン酸化あるいはユビキチン化など様々な修飾が知られている。これら修飾が遺伝子発現に及ぼす効果については未解析のままであるので、次年度以降も継続して解析を進めていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度の解析から、II型コラーゲンおよびアグリカンの各エンハンサー領域には、特異的に結合して機能している転写因子の存在が強く示唆された。そこで次年度は、まずII型コラーゲンのエンハンサーに結合している転写因子の同定を進める。具体的には以下に記載した方法により、まずは既知の転写因子について解析を進める。なお現在、哺乳動物細胞で機能しているの転写因子の数は、おおよそ 1,200～1,500 種類と見積もられている。しかし利用可能なデーターベースに登録されている転写因子の数は、概ね 800 から 1,000 種類程度である。そこで未知の転写因子の関与については、ラットの軟骨肉種細胞と正常軟骨細胞を用いたサブトラクション法を中心に、新たな方法の開発を含め、解析を進める予定である。
①既に論文として報告のある転写因子のうち、II型コラーゲンおよびアグリカンの各エンハンサー領域に結合する可能性が高いものを絞り込む。その際、Web 上に公開されている転写因子の解析プログラム（JASPAR, GenePaint 等）を用いて、エンハンサー の DNA 配列に特異的に結合する可能性が高い転写因子を絞り込む。
②①で絞り込んだ転写因子の野生型および変異型を、ラット軟骨肉腫細胞（我々がこれまで用いてきた細胞）で強制発現させて、II型コラーゲンおよびアグリカンの転写に対する影響を調べる。具体的には、独自に作成したサイレントレポーターシステムを用いて、解析を進める。尚、この解析系の有効性については、II型コラーゲンの転写制御に関わることが分かっている転写因子（Sox9）を用いて確認済みである。
③新たに特定された転写因子が、エンハンサーのどの部位に結合しているかについては、ゲルシフトアッセイ、あるいは ChIPシークエンス解析により確認していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
支出調整の際にミスがあり、１円ではありますが次年度に繰り越さざるをえなくなりました。次年度の助成金と合わせて、当初の計画通り大切に使わせていただきます。
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