| 研究課題/領域番号 |
18K06254
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
下條 博美 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特定助教 (40512306)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 神経幹細胞 / 神経分化 / 遺伝子発現動態 / ライブイメージング / 光遺伝学 / Neurogenin |
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| 研究実績の概要 |
哺乳動物の神経発生過程では、まず神経幹細胞が分裂・増殖を繰り返した後、厳密にコントロールされたタイミングでニューロン分化を開始する。この移行のタイミングがくるうと脳の形成不全が起こるため、その時間制御機構は極めて重要である。神経幹細胞の増殖やニューロン分化を制御する様々な因子が報告されているが、それらの因子の発現開始や終了のタイミングがどのように制御されているのかということは、よく分かっていない。私たちは以前、Notchシグナルの下流で神経幹細胞の維持に重要なHes1の発現が神経幹細胞においてネガティブ・フィードバックによって発現振動していること、Hes1の標的因子であるNeurogenin2 (Ngn2)やDelta1の発現もHes1の周期的な抑制を受けることで発現振動していることを明らかにした。さらに細胞が分化する際には、Hes1の発現が低下し、Ngn2やDelta1の発現が持続発現していた。これまで神経分化を誘導すると考えられてきたNgn2は、神経幹細胞では発現振動し分化を誘導せず、持続発現することでニューロン分化を誘導する。つまり、異なる発現動態を示すことで異なる細胞運命を導いていた。Ngn2の発現動態が切り替わることによって神経分化が引き起こされることから、遺伝子の発現動態の切り替わりの機序がわかれば、分化のタイミングを決定する仕組み、運命決定の時間制御機構を明らかにすることができる。Ngn2の発現はNotch-Hes1シグナルに依存することから、神経分化の過程においてHes1の発現が低下することがNgn2の発現動態の切り替わりを制御していると考えられた。そこで本研究では、神経分化過程においてHes1とNgn2およびその下流遺伝子の発現動態とその相関を明らかにし、光遺伝学を用いて分子機構を明らかにすることで、細胞運命決定の時間制御機構を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ngn2の標的遺伝子Tbr2は神経幹細胞からニューロンへの分化過程に出現するintermediate progenitorに分化誘導する転写因子である。私たちのこれまでの発現解析や機能解析から、Tbr2の発現が神経幹細胞で徐々に蓄積すること、さらにTbr2はHes1の発現を抑制することが分かった。Ngn2は神経幹細胞において発現振動することから、Ngn2のパルス状発現によってTbr2が発現誘導され徐々に蓄積されること、さらに蓄積したTbr2によってHes1の発現低下が引き起こされ、Ngn2の発現動態の切り替わりおよびニューロン分化期へ移行することが考えられた。そこでNgn2とTbr2の発現の相関を調べるために、Ngn2-FlucタンパクレポーターマウスとTbr2-Nlucタンパクレポーターマウスを作製し、両者を掛け合わせてダブルレポーターマウスを作製した。このレポーターマウスから神経幹細胞を回収し、分散培養を行なってNgn2とTbr2の発現を同時にモニターし、内因性のNgn2発現とTbr2発現動態との相関を解析しているところである。さらにhGAVPOシステムを用いた遺伝子発現の光誘導を用いて、Ngn2のパルス状発現を人工的に作り出し、同時に導入したTbr2タンパクレポーターの発現の解析を行った。その結果、Ngn2のパルス状発現に伴って、Tbr2タンパクの発現が徐々に蓄積することが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経分化の過程で徐々に蓄積するTbr2によってHes1の発現低下が引き起こされることが考えらえたため、Tbr2の発現動態とHes1発現との相関を明らかにするために、Tbr2-NlucタンパクレポーターマウスとHes1-d2EGFPレポーターマウスを掛け合わせ、ダブルレポーターマウスの終脳から回収した神経前駆細胞において二つのレポーターの発現の同時モニターを行う。両者の発現には負の相関が観察されたが、Tbr2の蓄積とHes1の発現レベルの経時的な定量解析を行っている。さらに、前駆細胞からニューロンが分化する際に見られる非対称分裂において、娘細胞へのTbr2タンパクの分配様式と細胞運命との相関が見られるか解析中である。さらに、光遺伝学を用いてTbr2の発現を人工的に誘導した場合におけるHes1の発現を調べるために、野生型マウスの神経前駆細胞にHes1プロモーターレポーターとTbr2の光誘導系、もしくはHes1レポーターマウスから取り出した神経前駆細胞にTbr2の光誘導系を導入し、Tbr2の発現を光で操作しながらHes1のプロモーター活性のモニターを行なっている。ここでもTbr2の発現とHes1の発現には負の相関が観察されているが、Hes1の振動発現に対して、Tbr2の蓄積量の作用を詳細に検討している。
マウス神経発生過程におけるTbr2のHes1発現制御および運命決定における機能を明らかにするために、Nestin-CreERT2マウスとTbr2-floxedマウスを掛け合わせ、終脳の神経前駆細胞においてTbr2をノックアウトしたマウス（Tbr2 cKOマウス）を作製した。このマウスにおけるHes1の発現レベルや細胞運命決定における変化を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において予定していた一部の解析を次年度に行うことになったため物品費として予定していた額よりも少額でおさえられた。また、旅費として予定していた分については学会等からのサポートを受けたため必要なくなった。これらは、翌年度、消耗品（試薬、実験動物）購入のための物品費として使用予定。
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