| 研究課題/領域番号 |
18K06279
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
小関 良宏 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50185592)
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| 研究分担者 |
廣瀬 由紀夫 愛媛県農林水産研究所, 企画環境部・農業研究部, 主任研究員 (40504147)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | アントシアニン / アシルグルコース依存糖転移酵素 / デルフィニウム / ニンジン |
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| 研究実績の概要 |
デルフィニウムにおける青色花の発色はアグリコンとしてデルフィニジンの 7 位にグルコース (Glu) と p-ヒドロキシ安息香酸 (pHB) が Glu-pHB-Glu-pHBと直鎖状に修飾されてビオルデルフィンとなり、さらにその 7 位の最初のGlu に分岐する形で Glu-Glu-pHB-Glu-pHB が結合し、シアノデルフィンが合成されている。本年度の研究においては、ビオルデルフィンに Glu および pHB を分枝させる形で結合させる酵素ステップに対する変異体のスクリーニングを行なった。その結果、ラベンダー色の花色を示す品種において分枝の途中で修飾が止まっている変異体を見出した。また、この修飾を司る候補酵素遺伝子の確定のためにゲノム編集による遺伝子破壊法を確立するため、各種デルフィニウム品種の種子からの植物体再生条件とアグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法の確立を試みた。アントシアニン合成変異ニンジン培養細胞においてはシアニジン (Cya) の 3 位に galactose (Gal) と xylose (Xyl) が修飾され、この Gal の先に Glu、さらにその先にシナピン酸 (Sin) が修飾されていることを明らかにした。そこでまずシアニジンに Gal を結合させる酵素について UDP-Gal を糖供与体とする細胞質型配糖化酵素に対する cDNA を得て、大腸菌組換えタンパク質における酵素の諸性質を解明した。また Cya-Xyl-Gal に Glu を結合する酵素について、ニンジン培養細胞からの粗タンパク質抽出液において、UDP-Glu ではなく Sin-Glu を糖供与体とする液胞型配糖化酵素であることを見出した。そこで、これをニンジン培養細胞抽出液から部分精製を行い、その生化学的な性質を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでの研究において、デルフィニウムの分岐鎖部分の Glu および pHB による修飾を司る酵素を同定するのについて、これまでに当研究者が見出してきた液胞型配糖化酵素遺伝子およびアシル化酵素遺伝子を用いた分子生物学的な相同性検索では見出せなかった。そこで本研究においては戦略を変えて、この修飾酵素遺伝子の変異体をスクリーニングすることを行なった。直鎖状修飾されたビオルデルフィンが示す花色の表現型は紫色であり、これに対して 2 本の直鎖修飾が分岐された形になっているシアノデルフィンを合成蓄積している花色の表現型は青色であることから、分岐した直鎖修飾部分の途中の修飾ステップが抑制された変異体の花色は紫色と青色の間の中間色ではないかと推定し、この推定を元に紫色と青色の中間色を示す品種を探索することにより、その途中の修飾ステップが抑制された変異体を見出すことができた。この変異体を見出したことは分子生物学的解析だけではなく、遺伝学的解析による責任遺伝子の同定を可能とするものである。また、ニンジンについてもアシルグルコースとして Sin-Glu を糖供与体とする Cya-Xyl-Gal への液胞型配糖化酵素活性を見出し、さらに部分精製することができた。特に粗抽出液において 20% - 35% 飽和硫安分画によってこの活性を示すタンパク質がこの画分に沈殿し、この初段のステップで多くの夾雑タンパク質を除去できることを明らかにできたことは、今後の精製ステップに向けての大きな成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
デルフィニウム花におけるアントシアニン修飾系については、未知の修飾ステップの変異体を見出すことができたので、次年度以降において、RNA-seq 解析法などにより、この変異体において発現が抑制されている遺伝子をシアノデルフィンまで修飾が進んでいる野生型において発現している遺伝子群と比較して見出すことで、この修飾ステップを司る酵素の候補遺伝子が同定できるものと期待される。さらにここで見出された候補酵素遺伝子について、デルフィニウム野生型植物からのゲノム編集法による遺伝子破壊個体を作出し、その花色表現型とともに蓄積しているアントシアニン分子種を同定することにより、この修飾反応の責任遺伝子を確定することが可能になるので、効率の高いデルフィニウム形質転換法の開発をさらに進める。またアントシアニン合成変異ニンジン培養細胞においては、前年度において到達した部分精製につき、次年度以降にさらにイオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどを用いてさらに精製段階を進め、クロマトグラフィー分離における酵素活性の溶出プロファイルと SDS-PAGE 上において検出される分離タンパク質のバンドの出現プロファイルとの間に相関関係が見られるバンドを切り出して精密質量分析法などによってアミノ酸配列を決定し、すでに公開されているニンジン全ゲノム配列からこのアミノ酸配列をコードしている候補酵素遺伝子を特定していくことを行う。
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