| 研究課題/領域番号 |
18K06391
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| 研究機関 | 日本女子大学 |
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研究代表者 |
今市 涼子 日本女子大学, 理学部, 研究員 (60112752)
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| 研究分担者 |
海老原 淳 独立行政法人国立科学博物館, 植物研究部, 研究主幹 (20435738)
藤浪 理恵子 京都教育大学, 教育学部, 講師 (40580725)
宮崎 あかね 日本女子大学, 理学部, 教授 (80293067)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 配偶体 / AM菌 / シダ / 共生 / 進化 / ハビタット / 培養 / 形態 |
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| 研究実績の概要 |
現生の陸上植物は、コケ植物、シダ植物から種子植物まで広く体内（シダ植物以上は根）にAM菌を感染させ、菌から水分やリン酸をもらい、そのかわり菌に光合成産物を供給するという共生関係をもっていることが知られている。
シダ植物の配偶体（前葉体）は大半が心臓形を示すが、サイズが数ミリと小形で根ももたず、しかも光合成能力をもつことから、これまで菌との共生関係は無いものと考えられてきた。しかし、最近の我々の先行研究から、遺伝子を用いて種同定されたシダ野生配偶体の大半が、配偶体の中肋部（中央の多層部）にAM菌を感染させていることがわかった。さらに菌感染率は配偶体のハビタットと強い関係をもち、地表（地上）に生育する配偶体の菌感染率は50～100%であるが、岩上や樹上着生のものの菌感染率は低く、多くが0％である事が示された。
我々は、シダ配偶体とAM菌との共生関係の詳細を知るため、土壌（黒ボク土＋川砂）を充填したシャーレ中でのAM菌とシダ配偶体の共培養実験を行った。その結果、シダ配偶体は（１）AM菌存在区と非存在区の間で、生育した配偶体に明らかなサイズ差（10倍以上）がみられる種、（２）菌感染は行うが、菌非存在区との間に有意なサイズ差が見られない種、（３）菌存在下においても菌が全く感染しない種、の3グループに区別され、シダ配偶体とAM菌との間に多様な共生関係が築かれていることが示唆された。
本研究では、シダ配偶体とAM菌の共生関係の解明を目指し、種ごとの野生配偶体の形態、ハビタット、菌感染率、菌感染部位等についてのデータベースの作成、ならびに配偶体とAM菌との共培養実験系を確立すべく研究を続けてきた。共培養実験については、培地として土壌を使うだけでなく、栄養条件（リン酸濃度）や配偶体の生育密度の調整が可能となる寒天培地等を用いた、より厳密な共培養実験系の開発を目指している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
FileMaker Proを用いた、種ごとの配偶体の形、ハビタット、菌感染率、菌感染部位などについてのデータベースの作成は進んではいるが、未だ未解析の採集済み配偶体が残っており、なおデータの補完が必要な状態にある。また、本研究の大きな目的の１つである、寒天培地を用いた共培養実験系の確立については、研究がやや遅れている。
昨年度、寒天培地にAM菌とゼンマイ胞子を播種する共培養実験を行ったが、菌の有無の違いによる配偶体サイズ差は2倍程度であり、土壌共培養系でみられた10倍もの明瞭なサイズ差とならなかった。普通、リンは土壌中では水に溶けたリン酸イオンとして土壌粒子に吸着した状態（土壌表面吸着無機態リン）で存在する。この土壌粒子に吸着したリンを植物体へ輸送する役割を担うのがAM菌の菌糸である。したがって土壌粒子に相当する構造物が存在しない寒天培地では、AM菌存在下と非存在下で配偶体の成長に大きな違いが出なかったものと推定される。
上記の問題を解決するためには、寒天中に何らかの粒子を加え吸着無機態リンを作る必要がある。今年度、土壌粒子を模した固体としてシリカゲルを混ぜた寒天培地を用いて、AM菌とゼンマイ配偶体との共培養実験を行った。しかし、結果として、菌存在区と非存在区の間で、配偶体の優位なサイズ差が生じなかった。しかも、菌存在区においてさえ配偶体に大小2倍ものサイズ差が生じ、小型のものには菌感染が見られなかった。AM菌の胞子発芽と菌糸の成長は、光によって阻害されることが知られている。シリカゲルを混ぜた寒天培地では、シリカゲル粒子によって光が反射、散乱し、AM菌の成長が抑えられたため、十分量の菌糸が作られなかった事が考察された。この結果を受け、現在は、シリカゲルの代わりに活性炭を用いた寒天共培養を試みている。残念ながら現時点で、寒天共培養実験系の確立には未だ至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
シダの種ごとの野生配偶体の形態、ハビタット、菌感染率、菌感染部位等についてのFileMaker Proを用いたデータベースの完成を目指し、最終年度となる来年度は、未解析の採集済み野生配偶体について解析を精力的に進め、データの補完を行う。
シダ配偶体の寒天共培養法に関しては、無機態リンを吸着させる土壌粒子の代用として今年度用いたシリカゲルがうまくいかなかったため、今後は、シリカゲルの代わりに活性炭を用いた実験を行う。この培養系の確立がなされた後、土壌共培養実験の結果から示唆された、シダ配偶体とAM菌との共生関係の3グループ（菌存在区と非存在区の間に有意なサイズ差あり、サイズ差無し、菌存在下でも菌感染無し）それぞれに代表的なシダ種を用いて、共培養実験を遂行する。
残念ながら活性炭を用いてもうまくいかない事も予想される。したがって、これと並行して、土壌粒子に匹敵する物質を含まない寒天だけの培地を用いた共培養実験も進める。寒天培地での共培養は、土壌を用いた共培養に比して、配偶体の生育密度や栄養状態をコントロールし一定にできるという有意な点があるからである。さらに、ゼンマイを用いてすでになされた寒天共培養実験では、菌存在区と非存在区の間での配偶体のサイズ差は、土壌共培養実験で得られた10倍には届かず2倍と小さかったものの、検定上は有意な差と認められるため実験系として成り立つと考えられる。この寒天共培養実験においても、土壌共培養実験から分類された3群、菌存在区と非存在区の間に有意なサイズ差がみられる種（コシダ、イヌガンソク等）、有意な差がみられない種（リョウメンシダ）、菌存在下でも菌感染を起こさない種（マメヅタ、ノキシノブ等）の区別が認められれば、3群の存在がより明瞭に示されることになり、シダ配偶体とAM菌の共生関係の解明に向けて大きく前進することになる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
野生配偶体のAM菌感染についてのデータベースの完成を目指して、採集済みで未解析の配偶体について種の分子同定、ならびに切片作成と顕微鏡観察等が必要であり、人件費・謝金が次年度も必要となる。
寒天共培養実験系の確立を次年度もめざすが、それと並行して、土壌粒子に匹敵する物質を含まない寒天だけの培地に戻した共培養実験も進める。土壌共培養実験で得られたシダ配偶体とAM菌共生関係の3群が区別されるかどうか知るためには、各群に代表的なシダを十数種用いて調べる必要がある。共培養実験に関しては、本年度より次年度により多量の実験がなされると予想されるため、物品費として一部を次年度に繰り越した。
野生配偶体が生育する土壌中のリン濃度の測定に関しては、昨年度にICP-AESとモリブデン青法が有効であることが確認された後、本年度は、寒天共培養法が確立できず上述の3群の存在が確定できなかったため、ほぼ休止の状態で現在に至っている。次年度は、寒天培養法の確立を待たずに、土壌共培養実験で区別された3群の野生配偶体の生育土壌中のリン酸濃度測定を実施する。土壌採取のための旅費ならびに実験試薬等の費用が見込まれる。
次年度は本研究の最終年度となるため、研究全般の総括と学術論文原稿の執筆を行う。総括のための研究連絡と英文校閲など論文作成のための費用が必要となる。
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