| 研究課題/領域番号 |
18K06391
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| 研究機関 | 日本女子大学 |
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研究代表者 |
今市 涼子 日本女子大学, 理学部, 研究員 (60112752)
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| 研究分担者 |
海老原 淳 独立行政法人国立科学博物館, 植物研究部, 研究主幹 (20435738)
藤浪 理恵子 京都教育大学, 教育学部, 准教授 (40580725)
宮崎 あかね 日本女子大学, 理学部, 教授 (80293067)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 共生 / シダ植物 / AM菌 / 配偶体 / リン酸 / 形態 / 進化 / ハビタット |
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| 研究実績の概要 |
4億年前の陸上植物の化石研究から、植物の上陸にはAM菌を含むケカビ類との共生が大きく関与したことが推定されており、現生の維管束植物は広く体内（シダ植物以上は根）にAM菌を感染させている。植物は菌から水やリン酸をもらい、そのかわり菌に光合成産物を供給する。
シダ植物の配偶体（前葉体）は大半が心臓形を示すが、サイズが数ミリと小形で根ももたず、しかも光合成能力をもつことから、これまで菌との共生関係は無いものと考えられてきた。しかし、最近の我々の先行研究から、遺伝子を用いて種同定されたシダ野生配偶体の多くが、配偶体のクッション層（中央の多層部）にAM菌を感染させていることがわかった。さらに種ごとの菌感染率は配偶体のハビタットと強い関係を示し、地表（地上）に生育する配偶体の菌感染率は50～100%であるが、岩上や樹上着生のものの菌感染率は低く、大半の種が0％である事が示された。本研究では、これまで野外で採集したシダ配偶体について、種ごとの野生配偶体の形態、ハビタット、クッション層の厚さ、菌感染の有無等についてデータを集積し、データベースの作成をめざしている。
我々は、先に、シダ配偶体とAM菌との共生関係の詳細を知るため、土壌（黒ボク土＋川砂）を充填したシャーレ中での配偶体とAM菌との共培養実験を行った。その結果、シダ配偶体は（１）AM菌存在区と非存在区の間で、生育した配偶体に明らかなサイズ差（10倍以上）を示す種、（２）菌感染は示すものの、菌非存在区との間に有意なサイズ差を示さない種、（３）菌存在下においても菌が全く感染しない種、の3グループに区別されることを明らかにした。これら3グループの配偶体は、AM菌への栄養依存関係を異にしているのか否か、培地として、土壌に比して、栄養条件（リン酸濃度）や配偶体の生育密度の調整が容易である「寒天」を用いた共培養実験系の完成をめざしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
野生シダ配偶体の菌感染率、感染部位である配偶体中肋部（クッション層）の厚さ等については、これまでに日本各地で採集した配偶体のほぼ全て（43種、1100個体）についてのデータが今年度に出そろった。今後はこれらのデータをもとに菌感染率と配偶体ハビタット、そして配偶体クッション層の厚さとの関係について、解析を行うだけとなっている。
これに対して、配偶体とAM菌の「寒天共培養実験系」の確立については、遅れている現状にある。本実験に用いるシダ種にはゼンマイを選んだ。その理由は、野生でほぼ100％のAM菌感染率を示し、すでに行われた黒ボク土を用いたAM菌との共培養実験において、「菌有り区」と「菌無し区」の間で10倍以上の配偶体サイズ差を示したからである。残念ながら、寒天を用いたM培地ではサイズ差が明瞭に見られなかった。培地のリン濃度は、Ｍ培地のリン酸二水素カリウムの濃度で調整した。
一般に土壌中のリンは、（１）自由水に溶けているリン酸イオン、（２）土壌粒子に吸着している無機態リン、そして（３）土壌粒子に吸着している難溶性の有機態リンに分類される。土壌中で植物はまず上述の（１）、次に（２）を吸収するが、（３）は使いにくいと考えられている。上述のように、先に行った寒天共培養実験ではゼンマイ配偶体にサイズ差が見られなかったが、これはAM菌有り区と無し区の両方で（１）のリン酸イオンが十分量存在するため、配偶体成長に差がみられなかったものと考察された。そのため（２）土壌粒子に吸着する無機態リン量の差を作るため、土壌粒子の代用として、シリカゲル、あるいは活性炭を混ぜた培地で実験を行った結果、活性炭で良い結果を得ている。活性炭を混ぜた場合、寒天培地が黒くなるため、AM菌が菌糸を成長させる際に、光を嫌う性質に合致した結果だと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
シダ配偶体とAM菌の寒天共培養実験においては、土壌に匹敵する粒子を寒天に加える必要があり、そしてその粒子は活性炭が候補として有効であることが、本課題のこれまでに実験から示唆されている。したがって、本研究では活性炭をまぜた寒天共培養実験系の確立を目指す。まず、活性炭の量をふって、寒天量に対する最適量を知ることが必要である。
本実験系が確立した後、実験開始時の本培地における、（１）自由水に溶けているリン酸イオンと、（２）土壌に吸着している無機態リンの濃度を、ICP-AESならびにモリブデン青法を用いて測定し、野生ゼンマイ配偶体の生育土壌のそれらと比較する。
さらに、培養開始時と終了時における寒天内の（１）リン酸イオンと（２）土壌吸着の無機態リンの量をそれぞれ測定し、（１）と（２）が実際に成長したシダ配偶体に取り込まれたか否かを確認する。
寒天共培養系が確立した後、寒天Ｍ培地のリン酸濃度をふる実験を行い、リン酸濃度の高低によってAM菌との共生関係が変化するか否かを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験が予定通りに進まなかったため、次年度使用額が生じた。次年度の使用計画は以下の通りである。（１）野生配偶体データベースの作成（アルバイト料、30万円）：配偶体の全形写真、クッション層顕微鏡写真、クッション層の厚さ、AM菌の有無、AM菌の存在部位（有の場合）、AM菌の顕微鏡写真、シダ種ごとの菌感染率等の結果をまとめ、データベースを作る。（２）寒天共培養実験を進めるための消耗品費（40万円）：薬品、ガラス器具等。（３）寒天共培養実験の培地、ならびに野生配偶体生育土壌の採集とリン濃度の測定（50万円）：寒天共培養実験で得られた結果の考察のために、野生配偶体が実際に生育している土壌を採取し、土壌中のリン酸濃度、無機態リンの濃度の計測する。また、そこに生育している配偶体の種を知るため分子同定を行う。（４）研究連絡費（20万円）：最終年度にあたり、研究連絡として国内出張を行う。
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