| 研究課題/領域番号 |
18K06464
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
梅嶋 宏樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40525375)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 神経発生 |
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| 研究実績の概要 |
神経突起は伸長する過程で先端に成長円錐と呼ばれる手のひら状の構造を形成する。成長円錐は様々なガイダンス分子受容体や細胞接着分子を発現しており、アクチン依存的なダイナミクスで周囲の環境を探索しながら適切な接続先へ神経突起の伸長を誘導する。成長円錐には多数のメッセンジャーRNA（mRNA）が存在しており、細胞体とは独立した翻訳機構により成長円錐特異的な遺伝子発現を実現することによってその機能を実現している。成長円錐における局所翻訳は神経突起の伸長やガイダンスに関与することが知られているが、局所翻訳が成長円錐においてどのように制御されているかについてはいまだ不明な点が多い。
本研究では、成長円錐の機能を実現するための局所翻訳メカニズムを明らかにすることを目指して、特にmRNAの化学修飾に注目する。mRNAのアデノシンN6メチル化修飾（m6A修飾）はmRNAの特定のアデノシンに可逆的にメチル基を付加することによってmRNAの翻訳効率や分解速度を制御することが知られている。現在、メチル基を付加する"Writer"、メチル基を消去する"Eraser"、m6Aに結合し翻訳効率やmRNA分解を制御する"Reader"と呼ばれる分子群が見つかっている。これらのm6A修飾関連分子の発現を分散培養下の海馬神経細胞においてRNAiを用いてノックダウンし、神経突起の形成・伸長に対する影響を検討する。さらに、子宮内電気穿孔法を用いて胎生期マウス大脳皮質でm6A修飾関連分子をノックダウンし、神経回路形成への影響を調べる。また、神経突起の伸長や誘導を促す神経成長因子等の投与によって起こる局所翻訳応答がm6A修飾関連分子のノックダウンによって変化するのかを調べることで成長円錐における局所翻訳へのm6A修飾の関与を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は研究代表者が所属を異動し新たに立ち上がった研究室に参加したことに伴い、研究環境や実験系を再構築する必要が生じたために研究の進捗に遅れが出ていた。今年度はマウス海馬ニューロン分散培養系を立ち上げ、m6A修飾関連分子のRNAiノックダウンベクターを遺伝子導入し軸索や樹状突起の形成・伸長に及ぼす効果を検討した。m6A修飾関連分子としてWriterであるMETTL14、EraserであるFTO、ReaderであるYTHDF1~3を対象とした。RNAiのノックダウン効率は免疫染色法によって確認した。いくつかの遺伝子についてはノックダウンにより軸索や樹状突起の伸長および細胞形態の変化などの効果が確認できた。また、胎生期マウス大脳皮質への子宮内電気穿孔法による遺伝子導入の系も立ち上げを進めており、次年度には結果を得られると期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
分散培養海馬ニューロンにおけるRNAiノックダウンで見られた軸索や樹状突起の伸長および細胞形態の変化の原因を検討する。ノックダウンした細胞においてアクチン骨格や微小管骨格を免疫染色または蛍光タンパク質を用いたライブイメージングにより可視化し正常な細胞に比べて変化が生じるかを調べる。さらに、子宮内電気穿孔法を用いて胎生期大脳皮質ニューロンにおいてm6A修飾関連分子をノックダウンし、神経細胞異動や軸索投射・樹状突起形成といった神経回路形成に関する影響を検討する。また、m6A修飾分子が成長円錐における局所翻訳に及ぼす影響を検証する目的で、局所翻訳を介して神経突起の伸長や誘導を促進する神経成長因子NGF、BDNF、軸索ガイダンス分子Netrin-1などの分泌因子を培養条件下の成長円錐に投与し、m6A修飾mRNAの増減やeIF3などの翻訳開始因子の共局在などが影響を受けるかを検討する。上記の研究に必要な機材は揃っており問題なく実施可能であると考えられる。ライブイメージングなど特殊な設備を必要とする実験に関しては研究協力者である京都大学の王丹博士と協力して行なう予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度、研究代表者の異動に伴って研究計画の遂行に若干の遅れが生じ、今年度実施予定であった神経成長因子投与の実験等を次年度に行なう事としたため次年度使用額が生じた。次年度は当初予定の実験と今年度からの実験を引き続き行なうために今年度未使用額と次年度分として請求した額を合算した額を使用する予定である。
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