| 研究課題/領域番号 |
18K06464
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
梅嶋 宏樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (40525375)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 神経発生 |
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| 研究実績の概要 |
神経突起が伸長する過程では突起の先端に成長円錐と呼ばれる手のひら状の構造が形成される。成長円錐には様々なガイダンス分子受容体や細胞接着分子が発現しており、アクチン骨格依存的な動きにより周囲の環境を探りながら適切な接続先へと神経突起を伸長させる。成長円錐には多数のメッセンジャーRNA（mRNA）が発現しており、細胞体とは独立したタンパク質翻訳機構により成長円錐に特異的な遺伝子発現を実現させることでその機能を実現している。成長円錐における局所翻訳は神経突起の伸長やガイダンスに関与することが知られているが、局所翻訳が成長円錐においてどのように制御されているのかについてはいまだ不明な点が多い。
本研究では、成長円錐の機能を実現するための局所翻訳メカニズムを明らかにすることを目指して、特にmRNAの化学修飾に注目する。mRNAのアデノシンN6メチル化修飾（m6A修飾）はmRNAの特定のアデノシンに可逆的にメチル基を付加することによってmRNAの翻訳効率や分解速度を制御することが知られている。現在、メチル基を付加する"Writer"、メチル基を消去する"Eraser"、m6Aに結合し翻訳効率やmRNA分解を制御する"Reader"と呼ばれる分子群が見つかっている。これらのm6A修飾関連遺伝子の発現を分散培養下のニューロンにおいてRNAiノックダウン法を用いて撹乱し神経突起伸長に対する影響を検討する。現在、いくつかの遺伝子においてノックダウンにより軸索や樹状突起の伸長および細胞形態の変化などの効果が確認できている。さらに実際の神経回路形成におけるm6A修飾関連遺伝子の役割を検証するために、子宮内電気穿孔法を用いて胎生期マウス大脳皮質でm6A修飾関連分子をノックダウンし神経回路の形成過程への影響を調べることも進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス海馬ニューロン分散培養系において、m6A修飾関連分子のRNAiノックダウンベクターを遺伝子導入し軸索や樹状突起の形成・伸長に及ぼす影響を検討した。m6A修飾関連分子としてはWriterであるMETTL14、EraserであるFTO、ReaderであるYTHDF1~3を対象とした。RNAiのノックダウン効率は免疫染色法により確認した。いくつかの遺伝子についてノックダウンにより軸索や樹状突起の伸長および細胞形態の変化などが確認できた。さらに効果が確認できた遺伝子に関してオフターゲットの可能性を排除するため、当該遺伝子を再発現させ表現型がレスキューできるかの確認を現在行なっている。そのうちFTOについては樹状突起の伸長阻害が見られたが表現型のレスキューが確認できなかったため、ノックダウンベクターの再評価が必要と考えられる。また、胎生期マウス大脳皮質への子宮内電気穿孔法による遺伝子導入の系の立ち上げも進めている。系の立ち上げはほぼ終了し、次年度はノックダウンベクターを大脳皮質に導入して生体における神経回路形成への影響を検討する。初年度に研究代表者の異動に伴って研究環境を新たに立ち上げ直す必要が生じたこと、また今年度は新型コロナウイルス感染対策への対応に伴う業務や出張の自粛などに関連して研究の進捗がやや遅れた。次年度は引き続き今年度予定していた実験を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
分散培養海馬ニューロンにおいてノックダウンによる表現型が見られた遺伝子についてレスキュー実験を引き続き進める。得られた表現型を詳細に調べるためにノックダウンした神経細胞におけるアクチン骨格や微小管骨格の構造を調べる。また、m6A修飾分子が成長円錐における局所翻訳に影響を及ぼすかを検討するために、局所翻訳を介して神経突起の伸長やガイダンスを促進することが知られている神経成長因子NGF、BDNF、軸索ガイダンス分子Netrin-1等を投与した際の応答が上記の遺伝子をノックダウンすることで変化するかを調べる。上記の遺伝子が生体の脳における神経回路形成に重要かどうかを検討するために、子宮内電気穿孔法を用いて胎生期マウス大脳皮質へノックダウンベクターを遺伝子導入し軸索や樹状突起の伸長への影響を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度に研究代表者の異動に伴って研究環境を新たに立ち上げ直す必要が生じたこと、また今年度は新型コロナウイルス感染対策への対応に伴う業務や出張の自粛などに関連して研究実施にやや遅れが生じたため想定よりも使用額が少なくなった。次年度は今年度に予定していた実験を引き続き行なうために今年度未使用額を使用する予定である。
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