| 研究課題/領域番号 |
18K06492
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
井端 啓二 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (30462659)
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| 研究分担者 |
幸田 和久 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40334388)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | プルキンエ細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、小脳平行線維－プルキンエ細胞シナプスの形成および維持において極めて重要な作用をするCbln1が、デルタ型グルタミン酸受容体（GluD2）に結合することによってシナプス後部にいかなる変化を誘導し、シナプス後部を成熟させLTDを可能とするかについての分子機構を、免疫染色法およびライブイメージング法などで明らかにすることである。本研究では、まずCbln1がGluD2に結合することによって、プルキンエ細胞どのような変化が起こるのかを調べる。本年度はまずCbln1-KOマウス由来のプルキンエ細胞に精製Cbln1を添加し、プルキンエ細胞のスパインの形態、GluD2の局在変化を免疫染色法で調べた。その結果、精製Cbln1添加後のGluD2の局在が大きく変化するのが観察された。さらにpH依存性の蛍光タンパク質をつなげたSEP-GluD2を用いたタイムラプスイメージングでGluD2の局在変化を調べる方法では、同一の細胞、スパインを観察可能であるため、Cbln1の添加前後の変化が観察しやすくなる。そのため、GluD2のどの場所にSEPをつなげるかを検討した。その結果、プルキンエ細胞のスパインに局在し、Cbln1との結合を阻害しないコンストラクトが得られた。このSEP-GluD2をCbln1-KOマウス由来のプルキンエ細胞で発現させ、精製Cbln1を添加し、タイムラプスイメージングを行った。その結果、免疫染色法と同様にSEP-GluD2の局在が大きく変化するのが観察された。これらの結果から、Cbln1によって引き起こされるシナプス後部の成熟過程でGluD2の局在変化が何らかの役割を果たしていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今後の研究に必要なSEP-GluD2のコンストラクトが得られたため、実験計画の通りに進める事が可能になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度は引き続きGluD2の局在変化を詳細に解析する。さらに、シナプス後部の成熟を調べるために１型代謝性グルタミン酸受容体や２型AMPA受容体、およびその補助サブユニットのTARP、細胞接着分子であるニューロリギンなどの局在を検討する。GluD2の細胞内C末端にはPDZリガンド配列が存在しており、そこに結合する足場タンパク質のPSD-93とS-SCAM、また同配列に結合してLTD誘導に関与するPTPMEGやdelphilinに関しても検討を加える。また、GluD2のPDZリガンド配列がいかなる意義を有するかを解析するために、同配列を欠失したGluD2変異体（GluD2ΔCT7）を発現するトランスジェニックマウスとCbln1/GluD2二重欠失（dKO）マウスを交配してGluD2ΔCT7-Cbln1 KOマウスを作製し、同様の比較を行う。
Cbln1は神経活動依存的に分泌される。小脳初代培養系で高濃度塩化カリウム－グルタミン酸（高KCl-Glu）処理を行うと、プルキンエ細胞の表面のGluA2量が減少するchemical LTDが生じるが、高KCl処理だけではCbln1は分泌されるものの、chemical LTDは誘発されない。そこで、シナプス形成後にも神経活動依存的に放出されるCbln1のシナプス後部への効果を検討するために、野生型マウス由来の小脳初代培養系において、高KCl-Glu処理、高KCl処理及び未処理の場合のプルキンエ細胞神経棘におけるシナプス分子の動態を解析し、神経活動依存的に分泌されるCbln1とLTD刺激によって分泌されるCbln1の機能的な差異を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
おおむね予定通りに執行したが、デジタルCMOSカメラが予定より安い価格で購入出来たために残額を次年度の物品購入用に繰り越した。
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