軸索ガイダンスにおけるリンクスの機能と作用機構

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06503
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 萬代 研二 北里大学, 医学部, 教授 (50322186)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: リンクス / 軸索ガイダンス / 細胞間接着 / 神経回路

研究実績の概要

発生過程における神経回路の形成には、軸索がガイドされて標的に正しく投射し、シナプスを形成することが必須である。この過程の破綻は種々の精神・神経疾患の発症の原因となりえる。しかし、神経回路の形成機構の全貌は解明されていない。研究代表者らは先行研究において、新規の軸索ガイダンス分子で膜貫通タンパク質のリンクスを見出し、この分子が受容体型チロシンキナーゼの機能を調節することによって末梢神経の神経回路の形成を制御すること、また、軸索間の細胞接着依存性に軸索をガイドして内包を形成することを明らかにしてきた。本研究では、リンクス遺伝子欠損マウスにおいて、これまでにそのガイダンス機構が十分に解明されていないある軸索の投射がほぼ完全に欠損していることを見出した。発生期のマウス脳では、リンクスはこの軸索が通過する脳の領域に発現していたが、軸索投射を形成する神経細胞には発現していなかった。したがって、内包の形成の機構と同様に、この軸索の投射の形成においても、リンクスが細胞接着依存性の軸索ガイダンス分子として作用して軸索の伸長とガイダンスを制御していると考えられた。そのため、この軸索が通過する脳の領域に発現するリンクスとトランスに結合し、軸索に発現する細胞接着分子を同定し、その分子の機能と作用機構を解明することによって、リンクスが関与している軸索投射の形成機構を解明することができると考えられる。本年度は昨年度に引き続いて、主としてこのような分子の同定に取り組んでいる。結果によっては、ヒトのリンクス遺伝子の変異に起因する遺伝病の発症の機構も明らかにすることができると考えている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成30年度から令和元年度にかけてリンクス遺伝子リポーターノックインマウスLinx (+/tEGFP) とリンクス遺伝子欠損マウスLinx (tEGFP/tEGFP) を用いて、上述した軸索投射とリンクス発現組織との空間的関係、ならびにリンクスの発現との時間的関係を解析した。このように、この軸索投射の形成におけるリンクスの機能の概要を明らかにすることによって、リンクスが非細胞自律性に機能しているという仮説を確立することができた。リンクスにトランスに結合する細胞接着分子の同定の実験については、種々の生化学的手法を用いて解析を行っており、複数のスクリーニング系を確立した。今後、それらを用いて見出した分子を多方面から解析して絞り込み、その分子の神経回路形成における機能を明らかにしていく。また、前年度見出した自律神経の神経回路の形成におけるリンクスの機能について、組織学的、生理学的手法を用いて解析を進めている。このように令和元年度の当初の目標は概ね達成した。一方、本研究で使用するCreドライバーマウスが、本来想定されない生殖細胞で遺伝子組換えを起こすことを見出し、その現象について共同研究を行い報告した。

今後の研究の推進方策

令和二年度は、前年度に引き続いてリンクスにトランスに結合する細胞接着分子の候補について、確立した生化学的手法および細胞生物学的手法を用いて、リンクスとの結合を解析する。また、同定されたリンクス結合分子とリンクスの発生期の脳における発現について解析し、両者の発現部位の時空間的関係を明らかにする。これらの解析によってリンクス欠損マウスの表現型を説明しうる真のリンクス結合分子の候補を見出す。その後、見出したリンクス結合分子の生体内での機能を、遺伝子欠損マウスを作成するなどして解明する。自律神経の神経回路の形成におけるリンクスの機能の解明については、リンクス遺伝子条件付き欠損マウスを用いた生理学的解析を中心に進める。

次年度使用額が生じた理由

動物飼育および抗体の購入に必要な費用が当初の見込みより少なかったため次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額は、少なめに見積もっていた令和二年度の動物飼育費と消耗品の購入費を増額することによって使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Optimizing Nervous System-Specific Gene Targeting with Cre Driver Lines: Prevalence of Germline Recombination and Influencing Factors (2020)
  • 著者名/発表者名: Luo, L.、19名略、Sinclair, J. L.、Stogsdill, J. A.、Traunmuller, L.、Wang, J.、Wortel, J.、 You, W.、 Abumaria, N.、 Beier, K. T.、 Brose, N.、 Burgess, H. A.、 Cepko, C. L.、 Cloutier, J. F.、 Eroglu, C.、 Goebbels, S.、 Kaeser, P. S.、 Kay, J. N.、 Lu, W.、 Luo, L.、 Mandai, K.、15名略、Kawabe, H.、 Craig, A. M.
  • 雑誌名: Neuron 巻: 106 ページ: 37～65.e5
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2020.01.008
  • 査読あり / 国際共著