| 研究課題/領域番号 |
18K06507
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
渡部 和彦 杏林大学, 保健学部, 教授 (30240477)
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| 研究分担者 |
村田 麻喜子 杏林大学, 保健学部, 講師 (00276205)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 運動ニューロン / TDP-43 / 筋萎縮性側索硬化症 / 凝集体 / 組換えウイルス / プロテアソーム / 熱ショック応答 / HSF1 |
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| 研究実績の概要 |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動ニューロンの選択的な変性脱落により死に至る最も過酷な神経変性疾患であり，ニューロン，グリアにリン酸化TDP-43蛋白を含む細胞質凝集体が出現する．我々はこれまで，ヒト正常TDP-43とそのC末断片を発現する組換えアデノウイルスをプロテアソーム阻害条件下で培養ニューロンや成体ラット・マウス運動ニューロンに感染発現させると，ALSに特徴的なリン酸化TDP-43を含む不溶性の細胞質粗大凝集体が高率に形成されることを報告した．一方，ALSを含む神経変性疾患に対する熱ショック応答の治療応用が近年注目を集めている．本研究では，培養ラット神経幹細胞由来分化ニューロンを用いたTDP-43細胞質凝集体形成モデルに対して，熱ショック応答のマスター制御転写因子であるheat shock transcription factor 1 (HSF1) を発現する組換えウイルスを共感染させたところ，TDP-43凝集体形成が顕著に抑制された．しかし，HSF1の制御下にある熱ショック蛋白HSP70, DNAJB2a/b, HSPB8, HSPH3を発現する組換えウイルスには明瞭なTDP-43凝集体形成抑制効果を認めなかった．そこで現在，cDNA マイクロアレイを用いてHSF1の下流で働くTDP-43凝集体抑制候補分子についての網羅的発現・機能解析を行っており，ALSに対する新規治療法開発の糸口に繋げていきたいと考えている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
１．ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43，HSF1およびその制御下にある熱ショック蛋白HSP70, DNAJB2a/b, HSPB8, HSPH3を発現する組換えアデノウイルスをラット神経幹細胞由来分化ニューロンに感染させた．その結果，HSF1組換えウイルスの共感染によりTDP-43凝集体形成が顕著に抑制されることを見出したが，HSF1の制御下にある熱ショック蛋白HSP70, DNAJB2a/b, HSPB8, HSPH3には明らかな抑制効果は認められなかった．
２．上記培養凝集体モデルについてcDNA マイクロアレイ解析を行ったところHSF1により2倍以上に発現が上昇する遺伝子は64個，HSF1による凝集体形成抑制に伴って2倍以上に発現が上昇する遺伝子は393個同定された．現在，これらTDP-43凝集体抑制候補分子についての発現および機能解析を行っている．
３．上記したTDP-43凝集体抑制候補分子の絞り込みに時間を費やしており，当初予定していた動物実験の遂行に遅れが生じている．
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きcDNA マイクロアレイ解析により得られた分子についての発現および機能解析を行い，TDP-43凝集体抑制候補分子の組換えウイルスを作製し，培養ニューロンでの効果を確認するとともに，2～3ヶ月齢ICRマウスの顔面神経にこれら組換えウイルスをTDP-43組換えウイルス，プロテアソーム阻害shPSMC組換えウイルスとともに注入接種する．接種3日後より2週間まで経時的に灌流固定し脳幹の凍結またはパラフィン連続組織切片を作成，組換えウイルスの軸索内逆行輸送による運動ニューロンでの導入遺伝子の発現および凝集体形成を蛍光で確認するとともに免疫染色，ウェスタンブロットで解析し．成体マウス運動ニューロンに対して凝集体形成抑制効果を有する分子を確定する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）TDP-43凝集体抑制候補分子の絞り込みに時間を費やし，当初予定していた動物実験の遂行にも遅れが生じており，組換えウイルス作製完了に伴う培養細胞実験および動物実験を次年度以降に行う必要がある．
（使用計画）培養細胞実験および動物実験に必要な備品，消耗品費（計1,041千円）；実験動物として3-4ヶ月齢ICRマウス200匹の購入に計160千円．実験試薬および抗体購入費として計440千円．器具消耗品費として培養基材，チューブ，ピペットなどに計441千円を計上．
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