| 研究課題/領域番号 |
18K06510
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
吉川 雅朗 日本大学, 医学部, 助教 (50451696)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ミクログリア / RNA-seq解析 / 神経血管ユニット |
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| 研究実績の概要 |
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は運動ニューロンのみが選択的に障害を受けるが、その中でも障害を受ける運動ニューロンと受けにくいニューロンがある。本研究では軸索変性した運動ニューロンにターゲットをしぼって組織学的解析と網羅的遺伝子発現解析を行うことで、障害を受けやすい運動ニューロンの特徴を明らかにする。
申請者は、ALSモデルマウスを用いて発症前の早期変化の特定を進めてきた。一連の解析により、ALSモデルマウスの脊髄において、運動ニューロンだけでなく神経血管ユニットも発症前に障害されており、様々な細胞種の軸索変性への関与が示唆された。そこで、どの細胞種で遺伝子発現変動が起きているか、シングルセル解析などから得られた遺伝子発現プロファイルやマーカー遺伝子を参考にして調べたところ、ミクログリアなどのマーカー分子が変動していた。ミクログリアの細胞数は、生後30日ではあまり変化はなく、生後32日あたりから急増する。このことから、ミクログリアの増殖のきっかけになるような現象がこの時期に起きており、一部のミクログリアが反応している可能性がある。
また、発現変動遺伝子のデータを用いた解析を進める中で、Regulatory motifsにおいて、特定の転写因子に関するものが上位であった。この転写因子はニューロン、ミクログリア、血管内皮細胞などでの発現が確認されている。しかしながら、転写因子であるため、免疫染色で細胞の形態を把握するのは困難である。そこで、陽性細胞で膜移行型の蛍光タンパクを発現するノックインマウスの作製に取り掛かった。
今後は、ALSで早期に軸索変性する運動ニューロンはどのような特性があるか、その周辺の微小環境（特にミクログリア）はどのような変化を起こしているのか解析していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、レーザーマイクロダイセクションした微量サンプルを用いて、軸索変性した運動ニューロンの解析を進める予定だったが、軸索変性の有無で混ぜてしまうと個々の細胞の特性や位置情報が消失してしまう。シングルセル解析などの技術が進んでいるため、個々の細胞の位置情報を保持したまま、解析ができないか模索した。いくつかのキットや手法を組み合わせることで、それが可能になる目処がたった。そのため、軸索変性した運動ニューロンのプロファイリングが計画より遅れている。
また、ミクログリアに関わる因子のカスケードが動いている可能性が示唆されるが、転写因子のため、その形態的な特徴をダイレクトに把握するのは困難である。そこで、陽性細胞で膜移行型の蛍光タンパクを発現するノックインマウスの作製を進めている。このマウスを用いて、陽性細胞の形態的特徴などの解析を試みる。ノックインデザインおよびガイドRNAの設計が終了し、ガイドRNAの切断効率を検証するために予備実験を行っており、順調である。次年度に行う工程は決まっている。
よって、全体的に見れば、やや遅れているが順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
軸索変性した運動ニューロンの解析を進める。具体的には、レーザーマイクロダイセクションで解析対象を回収後、RNA-seq法により軸索変性した運動ニューロン特異的に変動する遺伝子を同定する。
また、ミクログリアも発症前の早期に変化しており、その変化は運動ニューロンに影響を与える可能性が示唆されるため、運動ニューロンとの相互関係を明らかにする。ミクログリアの発生に関与する因子の陽性細胞で、膜移行蛍光タンパク質を発現させ、形態学的な解析を行うために、ノックインマウスの作製を進める。トレーサーの位置関係と合わせて、それぞれの領域の位置情報を保持した状態で、RNA-seq解析へ発展させる。
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