| 研究課題/領域番号 |
18K06528
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
大野 孝恵 帝京大学, 医学部, 准教授 (60508109)
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| 研究分担者 |
福田 諭 帝京大学, 医学部, 助教 (50425641)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脊髄運動ニューロン / 可塑性 / 皮質脊髄路 / シナプス除去 / ホールセル記録 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目標は、我々が可能にした運動ニューロンを含む成体マウスの脊髄ニューロンからのホールセル記録法を用いて、皮質-運動ニューロン直接結合の消失過程におけるシナプス除去メカニズムを明らかにすると共に、脊髄運動ニューロン自体の可塑性について解明することである。
初年度には、1) 前腕筋支配運動ニューロンよりホールセル記録を行い、皮質脊髄路軸索からのシナプスが形成される日齢と除去される日齢を正確にとらえる実験を進め、生後6-8日齢にかけてシナプス結合は強まり、10-13日齢でプラトーになり、14日例以降でシナプス除去が始まり21日例以降には完全に消失する事を示した（2018年度神経科学学会にて報告）。また、2) 前腕筋支配運動ニューロン以外の脊髄運動ニューロンにも皮質からの直接結合があること確認した上で、手指筋,前腕筋,上腕筋,上肢帯筋及び傍脊柱筋支配運動ニューロンでその結合頻度を比較したところ、霊長類で見られるような遠位筋優位の入力頻度の差があることがわかった（研究分担者が神経科学学会にて報告）。2019年度には、シナプス除去過程をより詳細に確認すると共に（2019年度北米神経科学学会にて報告）、3) シナプス除去過程に伴うシナプス可塑性の変化を観察し、シナプス除去に先行するLTPの減少とLTD出現を確認した。LTP, LTD出現前後でのpaired pulse ratioに変化が見られなかったことからpostによる現象と考えられ、脊髄運動神経細胞にも可塑性があることも確認し得た（未発表データ）。また、 4) Grin 2B-floxマウスの前腕筋支配運動ニューロンにCREを発現させて運動ニューロン特異的にGluN2Bをノックアウトすることにより運動ニューロンからのシナプス除去が阻害されることを、野生型でシナプス除去がおこる日齢以降での結合を観察することにより確認し得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請書の予定通り、1) 皮質脊髄路軸索からのシナプスが形成される日齢と除去される日齢を正確にとらえる、2) 前腕筋支配運動ニューロン以外の脊髄運動ニューロンにも皮質からの直接結合があるのかどうか確認した上で、霊長類で見られるような支配筋による入力頻度の差があるのか否かを、手指筋,前腕筋,上腕筋,上肢帯筋及び傍脊柱筋支配運動ニューロンで比較する、3) 皮質脊髄路シナプス除去に伴って見られるシナプス応答の変化をとらえる、の３項目は、上記研究実績の概略に記載した様に現時点までに概ね研究結果を出せており、国内外の学会にて報告済みである。4項目めの、運動ニューロン特異的にGluN2Bをノックアウトし、2Bの消失により運動ニューロンからのシナプス除去が阻害されるか否かを確認してシナプス除去過程の活動依存性を示す実験も、シナプス除去が阻害されるという結果で結論が出ているが、この結果報告は、Sama6Dノックアウトを用いて2Bと同様の実験を行うことにより、シナプス除去過程の遺伝学的要素を示す実験結果と合わせて報告する予定である。Sama6Dノックアウトマウスはすでに研究室内での繁殖に成功しており、近日中に実験開始を予定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは前年度に引き続き、GluN2Bの運動ニューロン選択的ノックアウトにより皮質運動ニューロン直接結合のシナプス除去が部分的に阻害されるという実験結果を確実なものにするため、コントロール群では直接結合が完全に無くなる生後３週齢以降７週齢までの結合頻度を野生型と合わせて再検討し、n数を追加する。その上で、Sema6Dノックアウトマウスを用いて、シナプス除去過程が阻害されるか否かを検討する。齧歯類に見られる一過性の皮質運動ニューロン直接結合の継時的変化と除去メカニズムを明らかにした上で、高等霊長類同様に直接結合が生涯残るマウスに対し、従来ある他の運動下行路（赤核脊髄路や網様体脊髄路など）がどうなっているのか解剖学的に確認するとともに、行動実験を行い、生得的運動ならびに習得的運動能力が変化していないかどうか確認する。その上で、一過性皮質運動ニューロン直接結合の存在意義に付いて検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本課題を継続するにあたり、2020年度以降に使用予定の実験動物ならびに各種試薬の等消耗品、研究の発表ならびに研究内容に関する討論の場としての国内および海外学会への参加費、更には、次の段階で必要な機器の購入のため、次年度使用額は必須なものである。なお、昨年度以降遺伝子改変動物を用いた実験がメインになっており、２系統の遺伝子改変マウスの繁殖ならびに維持の為にかなりの出費が予想される。
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