| 研究課題/領域番号 |
18K06531
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
幸田 和久 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40334388)
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| 研究分担者 |
藤原 清悦 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (10440322)
井端 啓二 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (30462659)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 小脳 / 恐怖条件付け / 高次脳機能 |
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| 研究実績の概要 |
近年、ヒトやサルの脳機能イメージング研究などから、小脳が運動のみならず高次機能や精神疾患にも関与することが示されているが、そのメカニズムについては不明な点が多い。そこで、まず、小脳のどの領域が高次機能に関与しているかを解明するために、小脳における神経活動マーカーの探索を進めた。C57Bl6マウスにカイニン酸を腹腔内投与し痙攣を誘発させると、小脳ではc-fos、junB、Npas4などの最初期遺伝子の発現が有意に増加することが定量的real time PCRにおいて確認されたが、発現量の増加率は海馬に比べると1桁下回っていた。一方、前脳において神経活動性マーカーとしてよく用いられるArcには有意な変化が見られなかった。最も活動依存性に変化の大きかったc-fos遺伝子のカイニン酸誘発痙攣における発現変化をin situ hybridizationにより検討した結果、小脳虫部の小葉IX、XのPurkinje細胞における発現上昇が最も顕著であった。現在、恐怖条件付けにおける小脳内のc-fosの発現変化を、条件付け後の時間経過に従って、定量的な解析を進めている。
また、恐怖条件付けなどのタスクによる活動性が変化したニューロンをマーキングし、さらにそのニューロンを光遺伝学的に操作するため、RAMシステムを用いたAAVウイルスベクターを作成した。RAMシステムとは、Npas4の結合配列を付加したc-fosのプロモーター下で関心遺伝子を発現させるものである（Sorensen et al. eLIFE 2016）。現在のところ、感染のマーカーとして、シナプシン プロモーターのもとでmCherryを発現、さらに活動性のマーカーとしてRAMのもとでチャネルロドプシン２を発現するウイルスベクターを作成した。また、安全キャビネット内でウイルスベクター接種をするシステムを確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
恐怖条件付けにおける小脳内のc-fosの発現の変化の部位特異性、およびその時間経過について、定量的解析を進めている。小脳におけるc-fosの発現の時間経過のプロファイルが前脳とは異なっており、これらの至適条件の検討に時間を要している。また前脳で見られるほどその発現量の変化が大きくはないため、定量的評価にはより繊細な解析が必要である。
AAVウイルスベクターの作成及びウイルスベクター接種のためのシステムのセットアップを行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
恐怖条件付けにおける小脳の神経活動をc-fosをマーカーとして定量的な解析を行う。特に小脳内の部位特異性を明らかにし、恐怖条件付けに関与する小脳の責任部位を特定する。
同部位へすでに作成したRAMシステムを用いたAAVウイルスベクターを導入して、行動によって活動が上昇するニューロンをマーキングすると同時に、光遺伝学的な操作による行動変容の実験を進めてゆく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
光遺伝学的実験の開始が遅れており、その実験に必要な機器の購入が遅れている。
次年度に必要な機器の購入を予定している。
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