| 研究課題/領域番号 |
18K06531
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
幸田 和久 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40334388)
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| 研究分担者 |
藤原 清悦 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (10440322)
井端 啓二 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (30462659)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 小脳 / 恐怖条件付け / 高次脳機能 |
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| 研究実績の概要 |
近年ヒトやサルの脳機能イメージング研究から、小脳が運動のみならず高次機能や精神疾患にも関与することが示されている。そこで、小脳のどの領域が高次機能に関与しているかを解明するために、小脳における神経活動マーカーの探索を進めた。C57Bl6マウスにカイニン酸を腹腔内投与し痙攣を誘発させると、小脳ではc-fos、junB、Npas4などの最初期遺伝子の発現が有意に増加することを定量的real time PCRによって確認したが、その増加率は海馬に比べると１桁下回っていた。最も活動依存性に変化の大きかったc-fos遺伝子のカイニン酸誘発痙攣における発現変化をin situ hybridizationにより検討した結果、小脳虫部の小葉IX、XのPurkinje細胞における発現上昇が最も顕著であった。恐怖条件付けにおける小脳内のc-fosの発現変化を、恐怖を想起させた後の時間経過に従って、定量的な解析を進めたが、海馬と異なり、コントロールに比べて小脳皮質の各細胞層において有意な変化は見られなかった。
海馬と比較するとc-fosの発現はカイニン酸誘発痙攣においても１桁少ないため、in situ hybridizationで直接c-fos発現の変化を見るよりもc-fosのプロモーターによって駆動される蛍光タンパク質の発現をリードアウトとする方が有利であり、また観察のタイミングによる変化も小さいと考えられる。そこで、Sorensen（eLIFE 2016）らが開発したRAMシステムを用いたAAVウイルスベクターを作成した。高力価のAAV-RAM-EGFP-hSyn-mCherryを作成し、小脳へ接種したところ、小脳ニューロンの基底状態での活動によって無視できないレベルのEGFPが発現してくることが判明し、神経活動マーカーとするには、Tet-OFFによる誘導可能なシステムとすべきことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症の蔓延による影響で、実験時間が大きく制限されたため、研究の進捗が大きく遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
恐怖条件付けにおける小脳の神経活動をc-fosの発現を手掛かりとして定量的な解析を行う。恐怖記憶の固定後の想起段階ではin situ hybridiaztionにおいて有意な変化が見られなかったため、その獲得の相における解析を行う。in situ hybridiaztionによる解析が不調である場合は、RAMシステムを活用して、蛍光タンパク質発現による評価を行う。
さらに、RAMシステムを用いて、恐怖条件付けにおける小脳ニューロン、特にPurkinje細胞の活動の解析を進め、恐怖条件付けに関与する小脳の部位特異性を明らかにする。また、同部位の光遺伝学的、化学遺伝学的操作による行動変容の実験を進めてゆく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症の蔓延によって研究活動が大きく制限されたため、研究期間の延長を申請し、認められた。
期間の延長であるので、予算の執行は従来の計画に従って行う。
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