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2019 年度 実施状況報告書

チロシンを特異的に検出可能な化学発光分析法の開発と創薬・診断技術への展開

研究課題

研究課題/領域番号 18K06599
研究機関長崎大学

研究代表者

岸川 直哉  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (90336181)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードチロシン / 化学発光 / アルカリホスファターゼ / 酵素活性測定 / リン酸化チロシン
研究実績の概要

タンパク質は生命維持に関わる重要な生体分子であり、その効果的な定量・解析法は様々な分野で必要とされている。タンパク質を構成するアミノ酸の中でもチロシンは、様々な酵素の標的となるアミノ酸残基であり、チロシンリン酸化の異常が発がんに関与することやチロシン代謝異常が種々の疾患の原因となることが知られている。このようなことから、チロシンに特化した分析法は、疾患の発症機構の解明や早期診断法の開発に有用であると考えられる。我々はこれまでに、化学発光試薬であるルミノール誘導体とチロシンとの混合溶液に紫外線照射を行うという単純な操作で、チロシン濃度に応じて増大する発光が観察されることを見出した。本年度は、この現象に基づいて、リン酸化チロシンをチロシンへと脱リン酸化する酵素であるアルカリホスファターゼの活性を化学発光により測定する手法の開発を行った。本法において、チロシンは強い発光を与える一方でリン酸化チロシンは極めて弱い発光しか与えない。従って、アルカリホスファターゼによるリン酸化チロシンからチロシンへの変換に伴う発光強度の増強に基づいてアルカリホスファターゼ活性の測定が可能である。最適反応条件を確立後、アルカリホスファターゼ活性の検量線を作成したところ、15-3000 U/L の濃度範囲において活性と化学発光強度の間に相関係数 r=0.996 の良好な直線関係が得られ、15 U/Lの検出下限 (blank + 3SD) が得られた。本法はアルカリホスファターゼ活性測定法として広く用いられている p-ニトロフェニルリン酸を基質とする比色法よりも高感度であった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

チロシンとルミノールの混液に紫外線を照射することで強い発光が生じるという現象を、チロシン変換酵素の活性測定に応用することに成功した。本法において、チロシンは強い発光を示す一方で、わずかに構造の異なるリン酸化チロシンは極めて弱い発光しか与えないことを見出した。そこで、リン酸化チロシンからチロシンへの変換に伴う発光強度の増強を利用することで、予想通りにアルカリホスファターゼ活性を化学発光測定することができた。本法は、特殊な酵素基質を用いることなく極めて簡便な測定操作でアルカリホスファターゼ活性を効率よく測定可能であった。

今後の研究の推進方策

チロシンとルミノールの混液に紫外線を照射することで強い発光が生じるという現象を、既にチロシンの化学発光マイクロプレートアッセイへと開発することに成功している。そこで次に、この化学発光反応を組み込んだ HPLC システムの構築を試みる。すなわち、試料中の各成分を HPLC カラムで分離後にオンラインで紫外線照射を行い、照射後の溶液をルミノールと混合して生じる発光を検出するシステムである。これにより、オキシトシンといったチロシンペプチドの HPLC 化学発光検出法の開発を試みる。また、フェニルアラニンヒドロキシラーゼといったアルカリホスファターゼ以外のチロシン変換酵素の活性測定法の開発を引き続き進めていく。

次年度使用額が生じた理由

本年度における検討では、研究室に現有の装置と試薬を用いて実施可能であったため。
使用計画としては、HPLC システムを構築するための機器の購入や新規酵素活性測定法開発に必要な試薬の購入に充てる予定である。

  • 研究成果

    (19件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 3件、 査読あり 3件) 学会発表 (14件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] Mansoura University(エジプト)

    • 国名
      エジプト
    • 外国機関名
      Mansoura University
  • [雑誌論文] Detection of hydrogen sulfide in water samples with 2-(4-hydroxyphenyl)-4,5-di(2-pyridyl)imidazole-copper(II) complex using environmentally green microplate fluorescence assay method2019

    • 著者名/発表者名
      El-Maghrabey Mahmoud H.、Watanabe Riho、Kishikawa Naoya、Kuroda Naotaka
    • 雑誌名

      Analytica Chimica Acta

      巻: 1057 ページ: 123-131

    • DOI

      10.1016/j.aca.2019.01.006

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Chromatographic methods and sample pretreatment techniques for aldehydes determination in biological, food, and environmental samples2019

    • 著者名/発表者名
      Kishikawa Naoya、El-Maghrabey Mahmoud、Kuroda Naotaka
    • 雑誌名

      Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

      巻: 175 ページ: 112782

    • DOI

      10.1016/j.jpba.2019.112782

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Development of ultrafast colorimetric microplate assay method for ubiquinone utilizing the redox cycle of the quinone2019

    • 著者名/発表者名
      Fukuda Mizuho、Qianjun Liu、Ohyama Kaname、Kishikawa Naoya、Kuroda Naotaka
    • 雑誌名

      Microchemical Journal

      巻: 1510 ページ: 104104

    • DOI

      10.1016/j.microc.2019.104104

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] 一酸化炭素検出を目的とする quinazolinone 型蛍光プローブの開発2020

    • 著者名/発表者名
      岸川直哉、坂元優介、黒田直敬
    • 学会等名
      日本薬学会第140年会
  • [学会発表] イミダゾール誘導体の生成に基づくα-アミノ酸に選択的な蛍光誘導体化2019

    • 著者名/発表者名
      岸川直哉、出口華菜子、Mahmoud Hamed El-Maghrabey、黒田直敬
    • 学会等名
      第79回分析化学討論会
  • [学会発表] ターピリジンへの変換に基づくベンズアルデヒドの蛍光定量法の開発とsemicarbazide-sensitive amine oxidase 活性測定への応用2019

    • 著者名/発表者名
      岸川直哉、Mahmoud Hamed El-Maghrabey、中谷太郎、黒田直敬
    • 学会等名
      第32回バイオメディカル分析科学シンポジウム (BMAS2019)
  • [学会発表] キノンをシグナル発生タグとして用いる化学発光免疫測定法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      佐藤雄大、岸川直哉、Mahmoud H.El-Maghrabey、黒田直敬
    • 学会等名
      第17回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム (PPF2019)
  • [学会発表] 14N/15N-酢酸アンモニウムを質量タグとして用いるα-ジカルボニル化合物の安定同位体誘導体 LC-MS/MS 定量法2019

    • 著者名/発表者名
      寶徳亮太、Mahmoud H.El-Maghrabey、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第17回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム (PPF2019)
  • [学会発表] イミダゾール生成反応に基づく脂質過酸化アルデヒドの誘導体化LC-MS/MS定量法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      岸川直哉、Mahmoud H.El-Maghrabey、黒田直敬
    • 学会等名
      第44回日本医用マススペクトル学会年会
    • 招待講演
  • [学会発表] 酸化ストレス評価を目的とする脂質過酸化物の誘導体化 HPLC 定量法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第59回日本臨床化学会年次学術集会
    • 招待講演
  • [学会発表] 銅イオン及び亜鉛イオンに対して異なる発色応答を示す比色プローブの開発2019

    • 著者名/発表者名
      清野奨太、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] Heck couplingに基づくアリールハライドの長波長発蛍光誘導体化の検討2019

    • 著者名/発表者名
      東嶋拓海、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] チロシンを選択的に検出可能な化学発光分析法によるチロシナーゼ活性測定法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      坪上彩香、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] 2,2’-ビイミダゾールへの変換に基づくグリオキサールの蛍光マイクロプレートアッセイの開発2019

    • 著者名/発表者名
      山道 彩 、Mahmoud Hamed El-Maghrabey、岸川直哉 、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] A non-enzymatic approach for immunoassay based on using quinones as chemiluminescence signal generators2019

    • 著者名/発表者名
      Mahmoud El -Maghrabey、Yudai Sato、Naoya Kishikawa、Naotaka Kuroda
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] 2,4-ジニトロフェニルヒドラジンによる誘導体化と紫外線照射反応を組み合わせたアルデヒドのHPLC-化学発光定量法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      鈴木 朝、Mahmoud Hamed El-Maghrabey、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [学会発表] 9,10-フェナンスレンキノン及び酢酸アンモニウムを用いるα-アミノ酸に選択的な新規発蛍光誘導体化反応2019

    • 著者名/発表者名
      長坂東奈、出口華菜子、Mahmoud Hamed El-Maghrabey、岸川直哉、黒田直敬
    • 学会等名
      第36回日本薬学会九州支部大会
  • [備考] 長崎大学生命医科学域(薬学系)薬品分析化学研究室

    • URL

      http://www.ph.nagasaki-u.ac.jp/lab/analysis/index-j.html

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公開日: 2021-01-27  

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