| 研究課題/領域番号 |
18K06601
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
坂倉 正義 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (20334336)
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| 研究分担者 |
三尾 和弘 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 材料・化学領域, ラボチーム長 (40470041)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シャコー・マリー・トゥース病 / MPZ / PMP22 / NMR |
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| 研究実績の概要 |
シャコー・マリー・トゥース病の疾患メカニズムを明らかにするために、ミエリン特有の膜重層構造形成（およびその破綻）におけるPMP22とMPZの役割を原子レベルで理解しようと試みている。今年度は標的をMPZに絞り、構造解析および相互作用解析を行った。
まず、前年度の解析でボトルネックとなっていた、リコンビナントヒトMPZの細胞外ドメイン（hMPZ-ECD）の収量の改善に取り組み、hMPZ-ECDを従来の10倍以上の収率で得るプロトコールを開発した。このhMPZ-ECDの重合状態をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により解析した結果、hMPZ-ECD が8量体と、それより重合度の低い複数の多量体の間の平衡状態として存在することが示された。本リコンビナントhMPZ-ECDは、膜重層化に必要不可欠と考えられる多量体化能を有していると考えられる。
続いて、hMPZ-ECDの多量体化機構を原子レベルで明らかにするため、X線結晶構造解析によりhMPZ-ECDの立体構造を決定した。この結果、結晶中において3種類（Cis/Trans/HtH）のドメイン間相互作用が観測された。一方、NMRを用いて溶液中におけるhMPZ-ECDのドメイン間相互作用解析を行った。NMRシグナルの濃度依存性解析、および交差飽和実験を行った結果、結晶中において相互作用が観測されない領域（ID領域）におけるドメイン間相互作用が観測された。
結晶構造解析により示された相互作用面のうち、HtH相互作用面が、溶液中におけるhMPZ-ECDの多量体化に寄与するか否かを検証するため、HtH相互作用面上に存在するW28の変異体（W28A）を調製し、SEC解析を行った。この結果、単量体由来ピークのみが出現したことから、HtH相互作用が8量体形成において重要な役割を果たしていることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【MPZの多量体化による膜重合メカニズムの解析】hMPZ-ECDの大量発現システムの構築に成功した結果、結晶構造解析、NMR相互作用解析等により、予想を上回るペースでhMPZ-ECDの多量体化メカニズムを解明することができた。一方、hMPZ-ECDの多量体化と膜重合を関連付けるためには、hMPZを介した膜重合化評価システムを構築する必要がある。これまで、このシステムの構築するために、リコンビナント全長hMPZを用いる予定であったが、十分な収量のリコンビナント発現系を構築することができなかった。一方、hMPZ-ECDについて十分な量のリコンビナントタンパク質を得る手法を確立できたため、このhMPZ-ECDを脂質分子と結合させ、疑似的な膜結合タンパク質として膜重合化評価システムを構築する道筋ができた。
【hMPZ-ECDとPMP22の相互作用解析】精製したPMP22とhMPZ-ECDの混合試料をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により分析したが、複合体形成を示す溶出ピークは観測されなかった。hMPZ-ECDとSECカラム（Superdex 200）のアガロース担体の間の相互作用により、hMPZ-ECDとPMP22の間の相互作用が阻害されている可能性があり、他のSECカラムを用いた再分析を試みる必要がある。
【PMP22の構造解析】これまでにPMP22の精製過程において二量体が多く出現することが問題となっていた。この二量体の出現が、脂質の酸化に由来する可能性があると考え、精製中のサンプルに脂溶性抗酸化剤を添加したところ、二量体の出現が抑制され、PMP22の純度を向上させることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
【MPZの多量体化による膜重合メカニズムの解析】結晶構造解析およびNMR解析により明らかとなったhMPZ-ECDの相互作用界面のうち、膜重層化に寄与する相互作用を特定する。相互作用面に位置する残基のAla変異体を調製し、W28A変異体と同様に、SEC・NMR解析を行い、各残基がhMPZ-ECDの多量体化に及ぼす影響を明らかにする。これと並行して、C末端にHis-tagを付加したhMPZ-ECDを調製し、Ni-NTA-lipidを介してnanodiscに結合させる。得られたhMPZ-ECD-nanodiscを用いてミエリン様の重層化膜モデルを再構成する。さらに各種hMPZ-ECD変異体を用いて、膜重合に重要な残基、およびドメイン間相互作用の特定を試みる。
【PMP22の構造解析およびhMPZ-ECDとPMP22の相互作用解析】今年度に改良したプロトコールを用いてPMP22を精製し、単独状態、およびhMPZ-ECDとの混合状態で結晶化・構造決定を試みる。また、前項のhMPZ-ECD-nanodiscにPMP22を導入し、PMP22がhMPZを介した膜重合に及ぼす影響について考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はhMPZ-ECDの解析を集中的に行い、PMP22の解析を最小限とした。このため、PMP22の精製に必要な試薬（界面活性剤等）の使用量が少なく、追加購入のために確保していた予算を次年度に繰り越した。次年度に繰り越した予算は、タンパク質試料調製のための試薬等、消耗品の購入に充てる。
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