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2019 年度 実施状況報告書

B型肝炎ウイルスの肝細胞侵入および増殖機構の構造生物学的解析

研究課題

研究課題/領域番号 18K06606
研究機関慶應義塾大学

研究代表者

横川 真梨子  慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 講師 (60648020)

研究分担者 大澤 匡範  慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードB型肝炎ウイルス / キャプシド / NTCP / 無細胞タンパク質合成 / タンパク質-タンパク質相互作用
研究実績の概要

B型肝炎ウイルス(HBV)が肝細胞に特異的に侵入する分子機構、およびHBVが宿主の肝細胞内で増殖する分子機構を構造生物学的に明らかにすることにより、HBVの肝細胞への侵入や宿主細胞内での増殖の阻害という新たな作用点を持つ画期的抗HBV薬を創製することを目指している。
本年度は、前年度に引き続きHBVの受容体であるNTCPの調製法確立を行った。無細胞タンパク質合成系にて不溶性画分として合成したNTCPを界面活性剤により可溶化し、HBVの外殻タンパク質のpreS1領域との相互作用解析を行ったが、調製したNTCPはpreS1結合活性を持たないことが分かった。そこで、無細胞タンパク質合成の反応液に脂質と界面活性剤を添加し、透析しながら合成反応を行うことで、NTCPをプロテオリポソームとして調製した。調製したNTCPリポソームがpreS1結合活性を有することを、共沈降実験により確認した。今後、preS1とNTCPリポソームの相互作用の溶液NMR解析を行い、preS1上のNTCP結合残基およびNTCP結合時のpreS1の立体構造を解明する。また、リポソーム中のNTCPのNa+・胆汁酸共輸送活性を確認する。
HBVの増殖に重要なキャプシドとLHBsの相互作用については、キャプシドと結合するLHBsの残基をさらに絞り込むため、preS1、preS2を短くしたペプチド5種の大腸菌発現系を構築し、解析に必要な量のペプチドを調製した。今後、溶液NMR法と等温滴定型カロリメトリーを用いて、各ペプチドとキャプシドの相互作用様式を定量的に明らかにする。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

PreSとNTCPの相互作用による肝細胞侵入機構の解明について、無細胞タンパク質合成系を用いて不溶性画分として合成したNTCPを界面活性剤で可溶化した場合は、preS1結合活性がほとんどないことが分かったため、NTCPの調製方法の変更が必要になった。そこで、反応液に脂質と界面活性剤を添加して透析を行いながらNTCPを合成することで、NTCPをプロテオリポソームとして調製することに成功し、preS1結合活性を有することを確認した。
キャプシドとLHBsの相互作用による宿主の肝細胞内におけるウイルス再構築機構の解明に向けては、キャプシドとペプチドを問題なく調製できており、両者の相互作用解析や立体構造解析を行う準備が整っている。

今後の研究の推進方策

無細胞タンパク質合成系を用いて調製したNTCPリポソームとpreS1の相互作用の溶液NMR解析を行い、preS1上のNTCP結合残基、およびNTCP結合時のpreS1の立体構造を明らかにする。
キャプシドとの結合に重要なLHBs中の領域を溶液NMR法により特定し、複合体の構造をX線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡法により解明する。

次年度使用額が生じた理由

<理由>
予定していた設備備品は購入が不要になったほか、サンプル調製法の再検討が必要となったことで立体構造解析に向けた大量調製を行わなかったため。
<使用計画>
研究計画の遂行には、今後、予定よりも多量の界面活性剤や脂質、無細胞タンパク質合成試薬などの消耗品が必要になるため、これらの消耗品を購入する予定である。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2019

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] Structural mechanism underlying G protein family-specific regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channel2019

    • 著者名/発表者名
      Kano Hanaho、Toyama Yuki、Imai Shunsuke、Iwahashi Yuta、Mase Yoko、Yokogawa Mariko、Osawa Masanori、Shimada Ichio
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 10 ページ: -

    • DOI

      https://doi.org/10.1038/s41467-019-10038-x

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Elucidation of the inhibitory mechanism of a sea anemone toxin, APETx1, targeting a human heart voltage-gated potassium channel, hERG1.2019

    • 著者名/発表者名
      松村 一輝、福田昌弘 、簗瀬 尚美 、秋元 まどか 、黒川 洵子 、横川真梨子、大澤 匡範
    • 学会等名
      第42回 日本分子生物学会
  • [学会発表] 電位依存性H+ チャネルHv1のアラキドン酸による活性化促進機構の解明2019

    • 著者名/発表者名
      村上玲、吉敷純、横川真梨子、松葉広昭、木村友美、川鍋陽、岡村康司、嶋田一夫、大澤匡範
    • 学会等名
      第63回 日本薬学会関東支部大会
  • [学会発表] 電位依存性 K+チャネルの膜電位依存的構造変化機構の解明2019

    • 著者名/発表者名
      日向寺孝禎、横川真梨子、藤田浩平、野崎智裕、嶋田一夫、大澤匡範
    • 学会等名
      第63回 日本薬学会関東支部大会
  • [学会発表] BTG2によるポリ A 分解促進機構の構造生物学的解明2019

    • 著者名/発表者名
      高嶋大翔、城えりか、横川真梨子、沢崎綾一、寒河江彪流、尾上耕一、星野真一、大澤匡範
    • 学会等名
      第63回 日本薬学会関東支部大会
  • [学会発表] リン酸化による転写因子FOXO3a の機能抑制機構の解明2019

    • 著者名/発表者名
      河津光作、中塚将一、横川真梨子、中村吏佐、木村友美、齋藤潤、佐谷秀行、大澤匡範
    • 学会等名
      第63回 日本薬学会関東支部大会

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公開日: 2021-01-27  

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