| 研究課題/領域番号 |
18K06608
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
宮内 正二 東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
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| 研究分担者 |
菊川 峰志 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (20281842)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | トランスポーター / 分子弁 / チャネル / 基質認識能力 / 輸送方向性 / モジュレーター / 起電性輸送担体 / 水素結合ネットワーク |
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| 研究実績の概要 |
ジペプチド・トリペプチドから様々な医薬品を輸送するオリゴペプチド輸送担体PEPTの基質輸送における分子弁の役割を明らかにするために、動物細胞発現系およびアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて、PEPTと相互作用をする化合物の探索および、その相互作用機構について詳細な検討を行った。更に、電気生理学的測定法により基質誘導電流の解析を行い、以下の研究成果を得た。
①His57と相互作用する可能性のある基質、ニコチン酸及びアミノベンゼン酸誘導体(3-amino benzoic acid等)は、PEPT発現卵母細胞に対してH+依存性の内向き誘導電流を誘起した。一方、コントロール卵母細胞は、これらモノカルボン酸によりH+依存性の内向き誘導電流は示さなかった。また、PEPT発現動物細胞および発現卵母細胞は、これらモノカルボン酸に対して顕著な取り込みを示さなかった。これらの結果より、ニコチン酸などモノカルボン酸は、H+共輸送系を変化させ、PEPTをプロトンチャネルへと変換するモジュレーターとして作用していることが明らかとなった。更に、内向き誘導電流は、メタ位のアミノ基の持つローンペアが重要であることがQSARの実験結果より明らかとなった。また、ニコチン酸およびアミノベンゼン酸誘導体は、PEPTの典型的な基質Gly-Sar同様、His修飾試薬DEPCによるHis57の修飾から保護した。これより、ニコチン酸やアミノベンゼン酸誘導体は、基質結合部位近傍に結合することが明らかとなった。水溶性ビタミン、ニコチン酸は、特異的な構造認識により分子弁に対して機能不全をもたらすことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度、分子弁に対して機能不全をもたらす脂溶性ジペプチドアナログおよび水溶性ビタミン、ニコチン酸は、PEPTをトランスポーターからチャネルへの変換するモジュレーターが基質近傍部位に結合することを明らかにした。このモジュレーターとPEPTとの相互作用は、特異的であることも実証され、次の段階として作動メカニズムの解明を行ってゆく。
PEPT類似のオリゴペプチド輸送担体PEPTsoの結晶構造 (PDB:2XUT)に基づき、PEPTのホモロジーモデリングを行い、その結果、基質のタンパク質内移動に重要である分子弁は、輸送活性に必須なアミノ酸残基His57と近傍に存在するアミノ酸残基Ser302との水素結合に変化をもたらす事により引き起こされていると考えられている。基質輸送における次のステップとしてHis57-Ser302分子弁がどの様に変化するか、これら様々なモジュレーターを用いて、様々な状態（基質結合状態あるいは基質放出状態）に対するドッキングシミュレーションを行い、モジュレーターがPEPTの、どの状態、どの部位、どの様に結合するかについて今後明らかにする。これに基づいて、分子弁の作動メカニズムの詳細を明らかにする。一方、部位特異的変異体を用いて、基質あるいはモジュレーターとの相互作用を熱力学的に測定し、基質とモジュレーターの誘起するトランスポーターの構造変化を解明する。
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| 今後の研究の推進方策 |
分子弁の存在を別のモデル輸送担体、Na+/モノカルボン酸共輸送担体(SMCT)においても明らかにし、輸送担体において普遍的なマシナリーの一つであることを明らかにしてゆく。研究の進め方として、SMCTに相同性の高いグルコース輸送担体vSGLUTの結晶構造 (PDB: 2XQ2)を鋳型とした、ホモロジーモデリングを行う。典型的な基質の一つ、2, 4-dichloro phenoxyacetate (2,4-D) とのドッキングシミュレーションを行い、比較的大きな基質結合ポケットを見出している。基質の2,4-Dのカルボキシ基とArg239とが静電相互作用をしており、また、Arg239アミノ酸残基が基質輸送の活性中心であることが推察されている。本研究では、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて、先ず、① Arg239のLys, His, Ala, Glu変異体SMCTの輸送活性を電気生理学的に検討する。それらの結果を速度論的に解析し、輸送の方向性、Na+ の電気化学ポテンシャルと基質輸送のカップリングにおけるArg239の機能的役割を解明する。②Arg修飾薬を用いた分子弁を破壊あるいは変形させた状態における基質輸送を解析し、分子弁の基質輸送サイクルにおける役割を明らかにする。更に、③基質結合に伴う熱量変化を測定し、基質結合に伴うトランポーターの構造変化を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品費が少し残が生じた。これは、次年度での電気生理関係の部品代にて有効利用することとした。
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