2018 年度実施状況報告書

セレノール(SeH)を活性素子とする膜結合型抗酸化酵素の合成と細胞レスキュー効果

研究課題

研究課題/領域番号	18K06617
研究機関	崇城大学
研究代表者	原武衛崇城大学, 薬学部, 教授 (40325668)
研究分担者	中村秀明崇城大学, 薬学部, 講師 (30435151)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	グルタチオンペルオキシダーゼ / セレン
研究実績の概要	本プロジェクトは，医薬への応用を視野に，天然型酵素グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)の触媒サイクルの中間体構造セレネニルスルフィド(－Se－S－)を模倣した両親媒性化合物に基づいた還元反応触媒活性を有する分子の創製を目指している。平成30年度は，本プロジェクトの中心として機能するGPx様活性の活性素子化合物1-oxo-hexadecyl-seleno-L-cysteine-methyl-Se-yl-S-L-penicillamine methyl ester (OHSeP)と，それを使ったOHSeP/ホスファチジルコリン(PC)混合リポソームの合成に着手した。出発物質として試薬業者から購入することを予定していた試薬(Seleno-L-cystinやL-Penicillamineなど)の供給が滞り，入手時期が遅れためOHSePの合成が予定通り進めることができなかった。それに伴い，OHSeP/PC混合リポソームの合成も遅れており，計画していた合成を完了させるまでには至らなかった。年度終盤になり，試薬を購入することが可能となり，OHSePの合成手技・操作の確立には一定の目処を立てることができた。平成30年度に購入したリポソーム調製用のエクストルーダ装置を使って所望の形態を有するリポソームの調製するための手技・操作を確立した。リポソームの調製には，飽和アシル鎖を有するPC (水素添加)やコレステロール(Chol)などを適宜混合し，有機溶媒に溶解させた。有機溶媒を緩徐に留去し脂質薄膜を形成させ，ソニケーションによりリポソームを形成させた。エクストルーダーを使って調製するリポソームの平均粒子径は約100 nmに調整する。動的光散乱法により，得られたPCおよびPC/Chol混合リポソームの粒子径および表面電位の測定なども実施した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由平成30度実施予定の実験項目には，本プロジェクトの中心として機能するグルタチオンペルオキシダーゼ様活性の活性素子化合物1-oxo-hexadecyl-seleno-L-cysteine-methyl-Se-yl-S-L-penicillamine methyl ester (OHSeP)と，それを使ったOHSeP/ホスファチジルコリン(PC)混合リポソームの合成を掲げていた。既発表の論文(ACS Omega, 1, 58-65, 2016およびMetallomics, 3, 702-709, 2011, Bioconjugate Chemistry, 19, 1831-1839, 2008)を参考にして，OHSePの合成に着手した。出発物質として試薬業者から購入することを予定していた試薬(Seleno-L-cystinやL-Penicillamineなど)の供給が滞り，入手時期が遅れためOHSePの合成が予定よりも遅れている。それに伴い，OHSeP/PC混合リポソームの合成も遅れており，その合成はまだ達成されていない。しかし，本プロジェクト計画において本年度の購入を予定していたリポソーム調製用のエクストルーダ装置は，昨年秋に購入することができた。PCだけを使って既に何度もリポソームを調製し，その操作手法は確実なものとしており，所望の形態のリポソームが合成することができるようになっている。
今後の研究の推進方策	平成30年度に予定していたOHSePおよびそれに続くOHSeP/PC混合リポソームの合成が遅れているので，令和1年度はその遅れを取り戻せるよう実験を推進する。入手が遅れた試薬類も，現在は購入依頼からそう長く待たずして入手することができる状況となっており，初年度の遅れを取り戻せるよう推進できるものと期待される。実験材料の合成と並行して，本年度以降の実施を予定しているsiRNAを使ったグルタチオンペルオキシダーゼ-4ノックダウン細胞の作製や細胞内活性酸素種の測定，細胞内セレン量および分布の測定，細胞内セレン量および分布の測定などの実験項目に早急に着手し，最終目標であるOHSePによる細胞レスキュー効果の評価実験に到達できるよう準備等を推し進める予定である。
次年度使用額が生じた理由	出発物質として試薬業者から購入することを予定していた試薬(Seleno-L-cystinやL-Penicillamineなど)の供給が滞り，試薬業者の供給状況により十分量入手できなかった。そのため，令和1年度にそれらを購入するために使用する予定である。