| 研究課題/領域番号 |
18K06652
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
東 恭平 東京理科大学, 薬学部薬学科, 講師 (10463829)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ポリアミン / N-結合型糖鎖 / 抗体医薬品 |
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| 研究実績の概要 |
購入したCHO DP-12細胞が抗IL-8抗体を生合成し、培地中に分泌するかどうかを確認することを目的に、MonoSpin ProAを用いて培地から抗体を抽出し、SDS-PAGE およびウェスタンブロット法を行ったところ、培地中に抗体の存在を確認することができた。そこで、ポリアミン生合成阻害剤の有無で72時間培養し、回収した培地から抗体を精製し、抗体濃度を調べた。その結果、細胞内ポリアミン量を減少に伴い培地中抗体の濃度が約30%低下した。一方、ポリアミンを外から添加すると抗体産生量の回復が認められた。次に、各培養条件から得た抗体に結合するN-結合型糖鎖の構造解析を行った。PNGase F処理して抗体からN-結合型糖鎖を切り出した後、蛍光誘導体化してHPLCに供した。その結果、細胞内ポリアミン量を減少させると抗体上のN-結合型糖鎖の結合量が著しく減少すること、およびN-結合型糖鎖のフコシル化が阻害されていることが示唆された。ポリアミンの有無で細胞内の糖ヌクレオチドの量が変化するかどうかをHPLCにより検討した。その結果、糖ヌクレオチドの組成および含量はポリアミンの有無でほとんど変化しなかった。以上の結果より、ポリアミンはオリゴ糖転移酵素およびフコシル化酵素の発現を調節することが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗体上のN-結合型糖鎖の構造がポリアミンの有無で変化したことから、研究実施計画は順調に進展していると考えられる。しかしながら、ポリアミンにより発現調節を受ける遺伝子の同定まで進んでいない。
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| 今後の研究の推進方策 |
ポリアミン減少に伴い、抗体に結合する糖鎖量が著しく減少すること、およびフコシル化糖鎖の割合が非フコシル化糖鎖に比べて減少していることから、オリゴ糖転移酵素およびフコシル化酵素に着目してポリアミンにより発現制御をうける遺伝子を探索する。ポリアミンにより発現調節を受ける遺伝子 (ポリアミンモジュロン)を同定した後は、レポーター遺伝子を用いてポリアミンによる合成促進機序の解明を行う。更に、ポリアミンモジュロンを過剰発現又は欠損させたときに糖鎖構造の揺らぎが抑えられるかどうかを検証する。
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