| 研究課題/領域番号 |
18K06733
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
浅見 行弘 北里大学, 感染制御科学府, 特任准教授 (70391844)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | メタロ-β-ラクタマーゼ |
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| 研究実績の概要 |
2018年度はこれまでに連携研究者によって調製・供給された糸状菌ならびに放線菌培養物のおよそ4,000検体の微生物培養液サンプルを用いてスクリーニングを行った。すなわち、メタロ-β-ラクタマーゼ阻害物質のスクリーニングを簡便に行う方法として、カルバペネム系のメロペネムと共存しているときに阻止円径の大きくなる物質のアッセイ系を独自に構築し、微生物培養液からのスクリーニングを開始した。さらにin houseの天然物化合物ライブラリーからのスクリーニングも実施した。スクリーニングは以下の一次から三次までを行った。一次スクリーニングとしてメロペネム含有培地上で阻止円が確認された検体、二次スクリーニングとしてメロペネム含有、非含有培地で選択性が確認できた検体、そして三次スクリーニングとしてメタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性が確認できた検体。その結果、強いメロペネム耐性克服活性を示し再現性のあった3検体の培養液を選抜した。この3検体について再培養後、活性物質生産が再現されることを確認した結果、海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株のそれぞれ培養液にメロペネム耐性克服活性が再現された。放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株は同種の可能性があり、かつ予備的な精製実験において活性画分の挙動が一致したことから、活性物質は同一物質である可能性が高いことが示唆された。そのため放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物を混合し、その培養物の活性物質を精製・単離した結果、cinnamic acidと同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度はスクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した培養液からの活性物質を精製していく計画を実施した。さらに、in houseの天然物化合物ライブラリーからのスクリーニングも実施した。 これまでにおよそ4,000検体の微生物培養液サンプルを用いて、スクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した3検体の培養液を選抜できた。海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養検体を精製対象候補検体として選抜した。KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物から単離した活性物質はcinnamic acidと同定した。本化合物はすでに放線菌の生産物として報告されていた。また植物界にも広く存在する芳香族不飽和カルボン酸に分類される有機化合物である。本化合物の生物活性は肥満抑制作用やPKG阻害活性など多岐にわたり報告されているが、メロペネム耐性を示す臨床分離大腸菌株においてメロペネム併用時にその耐性を克服する活性を示すことが明らかとなった。また、メロペネムを不活性化する酵素であるメタロ-β-ラクタマーゼに対する阻害活性試験を実施するために、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼのクローニングを行い、今年度はタンパク質発現ベクターの構築も実施した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後もメタロ-β-ラクタマーゼ阻害物質のスクリーニングを簡便に行う方法として、カルバペネム系のメロペネムと共存しているときに阻止円径の大きくなる物質のアッセイ系を独自に構築し、微生物培養液からのスクリーニングを用いる。連携研究者が分離したIMP型メタロ-β-ラクタマーゼが発現している臨床分離大腸菌株を検定菌として用いる本スクリーニングは有用であると考えられる。
さらに、連携研究者によって調製・供給される糸状菌ならびに放線菌の微生物培養液サンプルを用いて、メロペネム耐性克服活性を有する微生物培養液の選抜を2019年度も引き続いて行う。さらに、選抜された微生物培養液についてメロペネム耐性克服活性物質を単離・構造解析後に、in vitroでメロペネムを不活性化する酵素であIMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性試験を実施し、その阻害活性能を検証する。2019年度に取得された活性物質については、その活性物質の誘導体合成を計画する。一方、活性物質選抜後には、各種検定菌によるメロペネム耐性克服活性、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性の詳細な検討およびメロペネム併用時におけるメロペネム耐性菌の抗菌スペクトルを測定する。これらの試験によって優れた活性を示した活性物質については、連携研究者らによるメロペネムを併用したマウス感染モデル系での治療効果を検討する。
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