| 研究課題/領域番号 |
18K06737
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| 研究機関 | 鈴鹿医療科学大学 |
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研究代表者 |
廣森 洋平 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助手 (60515956)
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| 研究分担者 |
井戸 章子 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (00336629)
中西 剛 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (50303988)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 核内受容体 / 有機スズ化合物 / レポーターアッセイ / リガンド結合実験 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は前年度に引き続き、フジツボEcRおよびRXRのタンパクコード領域の解明を試みた。また、RXRに関しては、解明したリガンド結合領域(LBD)配列を用いて、レポーターアッセイによるアゴニスト活性評価およびRI標識リガンドを用いたリガンド結合実験を行った。
5'RACE法では未知領域の解明がうまくいかなかったため、遺伝子データベース上に参考になりうる情報がないか検索を行った。その結果、オオアカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボのRNA-seqデータが存在していたため、その配列を利用してEcRおよびRXRのタンパクコード領域配列の推定を行った。推定配列を基にプライマーを設計し、PCRを行ったが、目的とする配列の増幅は起こらなかった。現在、プライマーを設計し直して、検討を進めている。
LBD配列を基に組み換えタンパクを作成し、リガンド結合実験を行った。その結果、有機スズ化合物であるトリフェニルスズ(TPT)がフジツボRXRに結合することを示唆する結果が得られた。その一方で、哺乳動物におけるRXRの内因性のアゴニストである9-cis retinoic acid (9cRA)はフジツボRXRに結合しなかった。
同様に、ヒト絨毛癌細胞株であるJEG-3細胞を用いてレポーターアッセイを行うことでアゴニスト活性の評価を試みた。その結果、9cRAだけでなく、フジツボRXRに結合する可能性が示唆されたTPTにおいてもルシフェラーゼ活性の上昇は認められなかった。ルシフェラーゼ活性自体は確認されているものの、反応する化合物が認められなかったことから、実験系がうまく機能しているか確認する必要があると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
概要で示したように、全く成果が上がっていないわけではないが、本年度中にEcRおよびRXRのタンパクコード領域の解明が出来ず、また、レポーターアッセイに関してもさらなる条件検討が必要な状況であることから、当初目標としていた状況よりやや進捗が遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
EcRおよびRXRのタンパクコード領域配列の推定を行ったにもかかわらず、PCRがうまくいかない原因として、推定に用いた生物種がオオアカフジツボ、タテジマフジツボ、サラサフジツボであるのに対し、検討に用いている生物種がシロスジフジツボと、厳密には生物種が異なっていることに起因していると考えられる。それでもタンパクコード領域部分に関しては配列の大半がほぼ保存されていることが予想されるため、縮重プライマーを用いたPCRを行うことで、引き続き解明を進める。
レポーターアッセイでうまくアゴニスト活性が評価できていない要因として、細胞株（ヒト）とプラスミド（フジツボ）との生物種の違いが大きいことが考えられる。その対応策として、厳密には同一でないものの、ヒトよりもフジツボに近いと予想される昆虫の細胞株であるSF9細胞を用いて評価系の構築を試みる。また、他の核内受容体においてLBD部分だけでなく、全長を用いることで反応性が改善された事例があるため、全長配列が解明され次第、そちらも検討を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が発生した要因としては、新型コロナウイルスの影響により薬学会年会などの中止に伴い出張が取りやめになったこと、研究が思ったように進捗せず、方策を変更する必要に迫られたことなどが考えられる。
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