| 研究課題/領域番号 |
18K06814
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
北田 容章 関西医科大学, 医学部, 教授 (80324614)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 遺伝子組換え / 両生類 / 組織再生 / 蛍光蛋白質 / 細胞運命追跡 |
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| 研究実績の概要 |
内在性幹・前駆細胞の利用を念頭に置いた再生分野の研究では特定の細胞を標識しその細胞運命の追跡を行う必要があるが、この場合、主に遺伝学的な手法によるレポーター遺伝子の導入という手法が用いられ、特に部位特異的遺伝子組換えの手法が頻用される。本研究では、自発的に生じる再生により機能再建を果たす両生類であるゼノパスにおいて、部位特異的遺伝子組換えによるspatiotemporalな遺伝子発現制御を可能とするため、ゼノパスを始めとした両生類における部位特異的遺伝子組換えに資する遺伝子座位(safe-harborlocus)、あるいはそれに類する遺伝子座位を同定することや、同染色体内に遺伝子導入が生じない程度の低頻度な外来遺伝子導入を可能とする手法の開発を目的としている。2020年度は、2018年度～2019年度に作成したCre/loxPシステムあるいはFlp/FRTシステムによるトランスジェニック個体の作成を行った。制限酵素であるI-SceIおよびI-SceI切断認識サイトを有する外来遺伝子の胚内インジェクションを行い、下記のF0動物を得た。神経細胞特異的プロモーター制御下にレポーターとしてmKate2遺伝子を導入しているため、神経細胞及び軸索特異的にmKate2の赤色蛍光を確認している。また、ドライバーとして脊髄上衣細胞特異的プロモーター制御下に両端をERT2遺伝子にて挟んだ遺伝子組換え酵素を発現する遺伝子を導入した。こちらは蛍光蛋白質を含まないため、外来遺伝子として逆向きにクリスタリンプロモーター制御下にtdTomatoを組込み、眼球における赤色蛍光を確認することで導入遺伝子のゲノム内組込みを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現所属への異動や、新型コロナウイルスの蔓延により、進捗に遅れを来している。上述のとおりF0動物作出までは問題なく完了したため、1年間の遅れではあるが、2021年度にはF1動物作出と遺伝子組換え効率の確認が可能と考えられる。また、外来遺伝子導入の導入遺伝子座についても確認を行うことが可能であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在F0であるため、性成熟を待ってF1動物を作出後、外来遺伝子のゲノム内組み込みと遺伝子組換え効率の確認を行う必要がある。各個体における導入遺伝子座については、RACEあるいはNGSによるwhole genome sequencing等を用いて決定する予定としている。F0動物の作出は問題なく進めることができたため、性成熟を確認後、速やかにF1動物を作出、遺伝子組換え効率の確認を進める。また、外来遺伝子導入の導入遺伝子座についても確認を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現所属への異動と新型コロナウイルス蔓延に伴い、実験の進捗が遅れた。2021年度はF1動物の作出と、遺伝子組換え効率の確認、および外来遺伝子の導入遺伝子座の同定を行う。研究費は、動物の購入・維持、遺伝子組換え誘導薬（タモキシフェン）等の消耗品費や、次世代シークエンサーによるゲノム解読に関する業務委託費。及び学会発表のための国内旅費等に用いる。
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