| 研究課題/領域番号 |
18K06829
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
大崎 雄樹 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (00378027)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 脂肪滴 / 核膜陥入構造 / ホスファチジルコリン |
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| 研究実績の概要 |
中性脂質をリン脂質一重膜が覆う構造である脂肪滴は小胞体膜から形成される細胞質オルガネラと考えられて来たが、我々は肝由来細胞の核内では脂肪滴が核膜陥入構造と近接し、タンパク質修飾や遺伝子発現制御に関与するPML小体と複合体を形成して存在することを以前に報告した。本研究では核内脂肪滴の形成機序と機能をより詳細に解明することを目的とする。
初年度までの研究成果としては、1. 肝癌由来細胞では核内脂肪滴は小胞体内腔で形成されたリポプロテイン前駆体に由来すること、2. 小胞体ストレス負荷によりリポプロテイン分泌を阻害すると、余剰のリポプロテイン前駆体が小胞体内腔、核膜槽、核膜陥入構造内腔に逆流蓄積すること、3. 核膜陥入構造膜が自然崩壊することにより内腔のリポプロテイン前駆体が核質内脂肪滴となること、4. ホスファチジルコリン (PC) 新規合成経路の律速酵素CCT alphaが核内脂肪滴に集積し活性化されること、5. Perilipin-3は CCT alphaとは競合的に核内脂肪滴に結合し、Perilipin-3の発現量抑制によりCCT alphaの核内脂肪滴への局在と細胞のPC合成活性が増加し、さらに小胞体ストレスが軽減されることなどを見出し、報告した (研究発表論文1)。
これらの結果はストレスに晒された細胞において、核内脂肪滴がPC合成の起点となり小胞体の膜合成と容積拡大に寄与することで、小胞体ストレスを抑えるフィードバック装置として機能することを示唆した。一方、脂肪滴がPML小体と会合することにより遺伝子発現制御の足場となる可能性の追求については、脂肪滴-PML複合体に結合するDNA配列解析が未達成だが、複数の転写調節因子が新たに脂肪滴-PML複合体に局在することが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画における以下の到達目標について、進捗状況を述べる。
(A) 核内脂肪滴の核膜陥入構造に依存した形成機構の解明：電子顕微鏡解析およびライブイメージングにより、肝癌由来細胞における核内脂肪滴の形成機序のうち、小胞体ストレス下で増加する核膜陥入構造の形成はPML-IIの発現抑制により顕著に抑制され核内脂肪滴が減少したことから、PML-IIが核膜陥入を正に制御している上流因子であることが強く示唆された。次に、蛍光脂肪酸アナログを用いたFRAP assayなどにより小胞体内腔で形成されたリポプロテイン前駆体の核膜槽、内核膜陥入構造への逆流蓄積は酵素MTPに依存することが判明した。リポプロテイン前駆体を内包する核膜陥入部分にはLaminや内核膜貫通分子が存在せず、非常に脆い膜構造であることが示唆された。一方、核質に形成されたのちの脂肪滴の融合を司る分子候補を同定した。
(B) 核内脂肪滴のPC合成活性とERストレス応答への影響：細胞質だけでなく核内脂肪滴にも局在するPerilipin-3 WTを過剰発現させるとCCT alphaの核内脂肪滴への局在とPC合成活性が減少したが、核外搬出シグナルを付けて細胞質のみに発現するようにしたPerilipin-3 NESの過剰発現ではそれらは起こらなかった。したがって核内に局在するPerilipin-3が核内脂肪滴周囲へのCCT alphaの集積、PC合成活性を負に制御していることが改めて判明した。
(C) 核内脂肪滴の遺伝子発現調節への関与の検証：核内脂肪滴-PML複合体に結合するクロマチンDNA配列の網羅的解析は未達成であるが、複数の転写調節因子が新たに脂肪滴-PML複合体に局在することが判明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究計画における以下の到達目標について、今後の進捗方策を述べる。
(A) 核内脂肪滴の核膜陥入構造に依存した形成機構の解明： 肝癌由来細胞における核内脂肪滴形成機序の各段階に関与する分子機構の同定を継続する。とくに脂肪滴が核質に形成された以降の動体を司る分子候補の機能について、脂肪滴の融合やCCTalphaの活性化への影響を解析する。
(B) 核内脂肪滴のPC合成活性とERストレス応答への影響：Perilipin-3、および (A)で同定された分子候補の発現量操作を介したCCT alphaの核内脂肪滴での活性化が、PC合成亢進作用、肝由来細胞でのERストレス軽減、VLDL分泌機能回復、細胞生存などに対してどう影響するのか、短期的・長期的な効果を評価する。
(C) 核内脂肪滴の遺伝子発現調節への関与の検証：脂質合成、ERストレス応答因子の発現制御に関与する転写調節因子を中心に、核内脂肪滴局在分子の網羅的解析を進める。また現在までに核内脂肪滴局在が判明している転写調節因子については、脂肪滴結合に必要な条件（結合ドメインのアミノ酸配列や翻訳後修飾の有無、標的となる脂肪滴表層脂質やタンパク質の介在）の同定などを行うとともに、転写因子が実際に脂肪滴周囲で機能しているかどうかを調べるため、核内脂肪滴形成量の多い条件と少ない条件、およびPML-II分子の発現抑制などの条件において、標的遺伝子の発現量変動が見られるかどうかを、レポーターアッセイなどにより解析する。
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| 備考 |
名古屋大学プレスリリース
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