| 研究課題/領域番号 |
18K06855
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
安川 孝史 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (60291936)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ユビキチンリガーゼ / アルツハイマー病 / BRI2 / BRI3 |
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| 研究実績の概要 |
1）＜NRBP1 (nuclea receptor binding protein 1)は、Cul2と結合するだけで無くCul4Aとも結合することを明らかにした。＞ Cul4Aユビキチンリガーゼ複合体では、その基質認識サブユニットであるDCAF中のH-boxモチーフと呼ばれる配列が、DCAFとCul4Aの相互作用を橋渡しするアダプタータンパク質DDB1との相互作用に関与している。NRBP1は、Cul2と相互作用するCul2-boxと呼ばれる配列を有しているが、その配列中に、H-boxモチーフが存在することが判明した。そこでH-boxモチーフに変異を入れたNRBP1を作製し、野生型NRBP1とCul4Aへの結合能を比較したところ、野生型NRBP1がDDB1を介してCul4Aと結合したのに対して、H-box変異体では結合が見られなかった。
2）＜NRBP1は、C末に存在するLisHモチーフを介して2量体を形成し、Cul2、Cul4Aと複合体を形成することを明らかにした。＞ NRBP1のC末にはLisHモチーフと呼ばれるタンパク質の２量体化に関わる配列が存在するので、異なるタグを付加した野生型NRBP1と、LisHモチーフ変異体を作製し、２量体化並びにCul2,Cul4Aとの結合について解析したところ、野生NRBP1型のみが２量体を形成してNRBP1/Cul2/Cul4A複合体の形成が化能であった。
3）＜NRBP1とBRI2/BRI3間の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング系の構築を行った。＞ NanoLucルシフェラーゼの2つのサブユニット(Lareg BiT, Small BiT)をそれぞれNRBP1とBRI2/3のN末端あるいはC末端に融合させる発現ベクターを全て作製し、両融合タンパク質の全ての組み合わせを293T細胞に共発現させ、高い発光強度を示す組み合わせを同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
改良の余地は残っているが、NRBP1とBRI2/BRI3の相互作用を阻害する化合物の一次スクリーニング系を確立出来たので、概ね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)ドミナントネガティブCul2/Cul4A変異体を用いてNRBP1/Cul2/Cul4A複合体のユビキチンリガーゼ活性の検証を行う。
2)NRBP1とBRI2/BRI3間の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング系の構築においては、S/B比がまだあまり高くないので、それぞれ相互作用に必要な領域に絞ったNRBP1,BRI2/3の欠失変異体を作製して、相互作用の検出に最適な発光強度を示す組み合わせを同定する。
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