生下後の心筋分化誘導因子の同定：インビトロ心筋最終分化誘導法の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K06870
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 山田 充彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (10263237)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 心筋細胞 / 最終分化 / 周産期 / L型Ca2+チャネル / 増殖因子 / サイトカイン

研究実績の概要

本研究では，心筋細胞の最終分化誘導因子を，in vivoで同定することを目的とし、H30年度には種々の増殖因子・ホルモン・サイトカインの阻害薬の心室筋細胞分化度に与える効果を解析する計画を立てた。我々は、これまでにAT1アンジオテンシン受容体阻害薬カンデサルタン、FGF, VEGF, PDGF受容体阻害薬ニンテダニブ、カージオトロピン受容体阻害薬SC144、甲状腺ホルモン受容体阻害薬DBD、グルココルチコイド受容体阻害薬ミフェプリストンの効果を検討し終えた。その結果、ニンテダニブとSC144が、定量的な違いは有るものの、類似した顕著な心筋細胞分化抑制効果を有することを見出した。具体的には、これらの薬物をP0-30の間連日投与したマウスでは、心筋細胞の興奮収縮連関の要であるL型Ca2+チャネル電流の生下後の発達が約10日遅れ、そのためP30の時点で対照群よりも有意に活動電位に伴う細胞内Ca2+濃度上昇と左心室収縮能が低下した。またやはり、興奮収縮連関の要である左心室筋のT菅の生下後の発達は抑制されなかったが、対照群と比較してその構造が有意に乱れた。しかし、左心室の拡張は認められず拡張型心筋症にはならなかった。心筋の組織像はほぼ正常で、心筋細胞の肥大、委縮、壊死、アポプトーシス、炎症細胞浸潤、繊維化などは認められなかった。またこれらの薬物を与えたマウスのP30における血液生化学的検査はほぼ正常であり、少なくとも見かけ上、これらの薬物の他臓器への毒性は確認できなかった。これらの結果は、FGF, VEGF, PDGF, カージオトロピンのいずれかが、生下後の心筋細胞の最終分化に必要であることを示唆している。したがって、来年度以降、各因子受容体を心臓特異的にノックダウンすることにより、より詳細に生下後の心筋細胞の最終分化の分子機構が解明されるものと期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

上述のように、我々は当初H30年度に計画していた実験計画をほぼ完全に実施し、来年度につながる有意な成果を得た。

今後の研究の推進方策

来年度は、FGF, VEGF, PDGF, カージオトロピンの受容体をアデノ随伴ウィルスベクターにより、心筋細胞特異的にノックダウンし、生下後の心筋細胞の最終分化に起こる変化を検討する予定である。
この目的のため、我々は今年度、特殊な遺伝子改変マウス（LSL-Cマウス）を購入している。このマウスは、遺伝子にloxp-Sto-loxp-Cas9-GFPという配列がノックインされている。このマウスに、gRNA1-gRNA2-cTNT promoter-Cre（gRNA:ガイドRNA; cTNT:心筋トロポニンT）とい配列を持ったアデノ随伴ウィルスを感染させると、心臓特異的に標的遺伝子をノックダウンできる。またアデノ随伴ウィルスのタイターを調整することにより、一部の心筋細胞のみで遺伝子をノックアウトすることができるので、非特異的心筋細胞変化を生じる心不全を誘導することなく、特定遺伝子の心筋細胞最終分化への効果を検討できると期待している。

研究成果

• [雑誌論文] Prostanoid EP4 Receptor-Mediated Augmentation of Ih Currents in Aβ Dorsal Root Ganglion Neurons Underlies Neuropathic Pain (2019)
  • 著者名/発表者名: Zhang Hao、Kashihara Toshihide、Nakada Tsutomu、Tanaka Satoshi、Ishida Kumiko、Fuseya Satoshi、Kawagishi Hiroyuki、Kiyosawa Kenkichi、Kawamata Mikito、Yamada Mitsuhiko
  • 雑誌名: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 巻: 368 ページ: 50～58
  • DOI: 10.1124/jpet.118.252767
  • 査読あり
• [雑誌論文] PDGF-induced migration of synthetic vascular smooth muscle cells through c-Src-activated L-type Ca2+ channels with full-length CaV1.2 C-terminus (2018)
  • 著者名/発表者名: Guo Xiaoguang、Kashihara Toshihide、Nakada Tsutomu、Aoyama Toshifumi、Yamada Mitsuhiko
  • 雑誌名: Pflugers Archiv - European Journal of Physiology 巻: 470 ページ: 909～921
  • DOI: 10.1007/s00424-018-2114-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Physical interaction of junctophilin and the CaV1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakada Tsutomu、Kashihara Toshihide、Komatsu Masatoshi、Kojima Katsuhiko、Takeshita Toshikazu、Yamada Mitsuhiko
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 115 ページ: 4507～4512
  • DOI: 10.1073/pnas.1716649115
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Sonic hedgehog signaling regulates the mammalian cardiac regenerative response (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawagishi Hiroyuki、Xiong Jianhua、Rovira Ilsa I.、Pan Haihui、Yan Ye、Fleischmann Bernd K.、Yamada Mitsuhiko、Finkel Toren
  • 雑誌名: Journal of Molecular and Cellular Cardiology 巻: 123 ページ: 180～184
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2018.09.005
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Impact of chronic kidney dysfunction on serum Sulfatides and its metabolic pathway in mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamada Yosuke、Harada Makoto、Hashimoto Koji、Guo Ran、Nakajima Takero、Kashihara Toshihide、Yamada Mitsuhiko、Aoyama Toshifumi、Kamijo Yuji
  • 雑誌名: Glycoconjugate Journal 巻: 36 ページ: 1～11
  • DOI: doi: 10.1007/s10719-018-9850-7
  • 査読あり
• [学会発表] Molecular mechanisms underlying spatiotemporal regulation of L-type Ca2+ channels in muscles. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada, M.
  • 学会等名: ogic of life: ion channel structure, function and physiology. International commemorative symposium in celebration of retirement of Professor Yoshihisa Kurachi
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Interaction of junctophilins and the CaV1.1 is essential for the skeletal muscle contraction (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsutomu Nakada, Toshihide Kashihara, Masatoshi Komatsu, Mitsuhiko Yamada
  • 学会等名: FAOPS 2019
• [学会発表] EP4 receptor-mediated augmentation of Ih currents in A-beta DRG neurons underlies neuropathic pain (2019)
  • 著者名/発表者名: 31.Yamada, M., Zhang, H., Kashihara, T., Nakada, T., Tanaka, S., Ishida, K., Fuseya, S., Kawagishi, H., Kiyosawa, K., Kawamata, M.
  • 学会等名: FAOPS 2019
  • 国際学会
• [学会発表] PDGF induces migration of synthetic vascular smooth muscle cells through c-Src-dependent activation of full-length CaV1.2 L-type Ca2+ channels (2018)
  • 著者名/発表者名: Kashihara, T., Guo, X., Nakada, T., Yamada, M.
  • 学会等名: 18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology (WCP2018)
  • 国際学会
• [学会発表] Physical interaction of junctophilins and CaV1.1 subunits is essential for the excitation-contraction coupling of the skeletal muscle. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakada, T., Kashihara, T., Komatsu, M., Yamada, M.
  • 学会等名: 18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology (WCP2018)
  • 国際学会
• [図書] 熱血 循環器学 (2019)
  • 著者名/発表者名: 井上信孝、山田充彦
  • 総ページ数: 244
  • 出版者: 洋學社
  • ISBN: 978-4-908296-14-7
• [備考] 信州大学医学部分子薬理学教室ホームページ
  • URL: http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/chair/i-yakuri/index.html
• [備考] 信州大学医学部ホームページ
  • URL: http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/department/medical_science/course/course06.php
• [備考] Shinshu University Graduate School of Medicine
  • URL: http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/eng/graduate/course/36518.html