| 研究課題/領域番号 |
18K06885
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
佐藤 岳哉 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (10312696)
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| 研究分担者 |
戸田 法子 東北大学, 大学病院, 助教 (50375052)
斎藤 将樹 東北大学, 医学系研究科, 助教 (50400271)
野村 亮介 東北大学, 大学病院, 助教 (90400358)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | オートファジー / ミトコンドリア / LC3B |
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| 研究実績の概要 |
オートファジーは、細胞内に蓄積する毒性高分子(変性タンパク質)などを分解する仕組みである。オートファジーはER膜等に由来するオートファゴソーム膜形成から開始し、Rab分子群および関連タンパク質群による膜輸送系により進行する。申請者は、抗がん薬・抗ウィルス薬等がミトコンドリア機能障害により誘発される薬物誘発性致死性心筋症の分子機構の検討過程で、薬物がオートファジーを阻害することなどを見出した。薬物誘発性致死性心筋症発症する薬物のオートファジー阻害の分子機序を詳細に解析し、さらにこの機序に基づく薬物誘発性致死性心筋症誘の治療法開発の礎を確立することを目的とする。今年度は、実験系の確立に注力し研究を行なった。ラット心筋由来H9c2細胞を用い、実験系を以下に述べる方法で確立した。オートファジー関連分子欠損細胞系の構築： オートファジーを制御する分子群をshRNA発現レンチウィルスシステムを用いて上記遺伝子の発現を減弱させた細胞を作成した。遺伝子の欠損は逆転写PCR等で確認した。これらの細胞を以下の検討で使用した。薬物のオートファジーに対する影響。オートファジー制御分子を欠損させた細胞において、薬物によるオートファジー阻害の有無の確認をミトコンドリア外膜Tomm20の量的変化あるいはオートファゴソームマーカーLC3-IIの量的変化を指標として評価した。薬物により障害されたミトコンドリアの細胞内蓄積量の評価：ミトコンドリアを特異的に染色するMitotracker Greenを用いて細胞を染色した後、細胞あたりのミトコンドリア量をFACSにより定量した。薬物障害ミトコンドリア産生活性酸素分子種(ROS)の評価：ミトコンドリア産生ROSを検出するMitoSOXで細胞を染色し、その蛍光量を蛍光プレートリーダーで用いて定量した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までに、予定通りの進行状況である。shRNAの効果が不十分なものがあるので、それについては新たなshRNAをデザインして、その効果を今年度の初期に早急に行うようにする。
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| 今後の研究の推進方策 |
薬物が阻害するオートファジー制御に関連するノックアウト細胞に対して、オートファジー制御分子を新たにノックインして、その機能を回復させる。ノックイン細胞とノックダウン細胞に対して薬物処理を行ったのち、ミトコンドリア細胞内蓄積量の変化、ミトコンドリア活性酸素産生量の変化、ミトコンドリア膜電子の変化などからミトコンドリア機能を検討し、オートファジー活性の評価、さらにリソソーム機能評価などを検討することにより、オートファジー制御分子の機能を評価する。さらにRNA干渉法によるオートファジー関連Rab分子群の網羅的探索と機能評価：薬物誘導性オートファジー障害に関連するRab分子を探索するため、薬物処理後、薬物によるオートファジー障害に影響を与えるRabの網羅的検索を行う。さらに、この検討で見出したRab分子の薬物による機能および局在変化についてRab分子の恒常的活性化体や機能阻害体等も用いて、オートファジーにおけるRab分子の役割を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究遂行の過程において、上記次年度使用額が生じた その理由として、研究に使用する物品の購入を、効率的に物品の購入を行なったためである。残額は、次年度の本研究課題遂行のための消耗品の購入に使用する。次年度においても物品購入に関し、効率的に購入を行い研究を遂行する予定である
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