| 研究課題/領域番号 |
18K06953
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
倉田 盛人 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40451926)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | がん遺伝子 / NRAS / CRISPR library |
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| 研究実績の概要 |
RASは多くの癌種において増殖に関与する癌遺伝子と広く知られている。シグナリングに関しても非常に多くの研究がなされており、これまでの報告からRASシグナルは増殖だけでなく、細胞老化など非常に複雑な多様性が報告されている。また、既存の下流分子の阻害剤のみでは癌抑制には至らないことも知られており、シグナリング全貌の把握が今後の癌研究に必要であると考えている。申請者はこれまでに、内因性のNRASをCRISPRでノックアウトしつつ、テトラサイクリン(ドキシサイクリン)誘導型ベクターでNRASの発現を調整できる細胞の樹立を行ってきた。ドキシサイクリンによってNRASの発現量を調節することによって、シグナルの多様性を再現することが可能である。この系を用いてNRASシグナルの網羅的な解析を遂行中である。
1.CRISPR libraryを用いた解析：ランダムな変異を誘導するCRISPR knockout libraryを用いて、NRAS発現量依存的シグナルの解明を行った。当該年度は、ドキシサイクリンを取り除いた細胞周期が停止する状態に対して、CRISPR libraryで細胞増殖が保たれるクローンの誘導を試みた。6×10<sup>6</sup>の細胞から12クローンの樹立に成功した。組み込まれているガイドRNAを解析し、候補遺伝子が得られた。
２．次世代シークエンサーを用いた解析：ドキシサイクリン濃度が過剰状態（＝NRASの発現が高い状態）において、細胞老化が観察された。ドキシサイクリン濃度依存的に発現量の異なる遺伝子68個を同定した。そのうち49遺伝子は、NRASの発現量依存的に発現が亢進したにも関わらず、過剰発現にて再度発現量の減少が見られる奇怪な挙動が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画通りに進んでいる。CRISPR libraryと次世代シークエンサーを用いた解析に着手でき、今後さらなる検証は必要なものの、候補分子が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きNRASシグナルの網羅的な解析を行う。CRISPR libraryを用いた解析では、ランダムに遺伝子の活性化を行うActivation libraryのscreeningも行う予定である。また、NRASが高発現の状態において、細胞老化をキャンセルできるクローンの樹立を試みる。
また、得られた候補遺伝子に関してはスクリーニングと同様の表現型が得られるか検証を行う。
次世代シークエンサーの解析より得られた候補遺伝子においても、シグナル内における働きを検証する。
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