| 研究課題/領域番号 |
18K06955
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
堀 一也 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (50749059)
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| 研究分担者 |
青木 耕史 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40402862)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 大腸癌 / CDX1 / CDX2 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題において我々は、ホメオボックス転写因子であるCDX1とCDX2による、大腸癌細胞の癌幹細胞性維持に関わる遺伝子群（癌幹細胞性関連遺伝子）の発現制御機構の解明を進めている。これまでに、ChIP-seq法により、CDX1とCDX2が結合するゲノム領域を網羅的に解析した。その結果、癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節領域や、遺伝子内またはその周辺において、CDX1とCDX2が結合するゲノム領域を多数同定した。これらの結果をもとに、CDX1とCDX2がゲノムに結合することで生じる、ヒストン修飾によるクロマチンの構造変化を検証した。最初に、Flag-CDX1またはFlag-CDX2をTetシステムにより発現誘導した大腸癌細胞株を用いて、遺伝子発現調節に重要となる各々のヒストン修飾を特異的に認識する抗体でクロマチン免疫沈降を行った。そして、ChIP-qPCR法により、CDX1とCDX2の結合ゲノム領域のヒストン修飾の変化を解析した。その結果、CDX1とCDX2が結合するゲノム領域において、H3K27acやH3K4me1などの、開いたクロマチンのマークとして知られているヒストン修飾が増加することを明らかにした。一方、抑制的マークとして知られるH3K4me3のヒストン修飾は減少していた。さらに、MNase-qPCR法により、CDX1とCDX2の発現により誘発されるクロマチン構造の変化を確認したところ、CDX1とCDX2の結合領域ではクロマチン構造が弛緩していることを明らかにした。これらの結果から、CDX1とCDX2は、本研究により同定したゲノム領域を介して、癌幹細胞性関連遺伝子の発現を制御していると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの解析により、大腸癌細胞の癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節領域において、CDX1とCDX2が結合するゲノム領域を同定した。さらに、CDX1とCDX2がゲノムに結合することで生じる、クロマチンの構造変化を検証した。その結果、CDX1とCDX2の結合ゲノム領域では、クロマチン構造が弛緩していることが分かった。一方、我々はこれまでに、CDX1とCDX2は、大腸癌幹細胞性関連遺伝子の発現量を顕著に低下させることを明らかにしている。したがって、CDX1とCDX2による癌幹細胞性関連遺伝子の発現抑制は、これまでに知られているエピジェネティックな遺伝子発現制御とは異なることを明らかにした。現在、癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節に鍵となる、CDX1とCDX2が結合するゲノム結合領域を決定するために、レシフェラーゼレポーター解析を進めている。また、癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節に関わる、CDX1とCDX2と相互作用する分子を網羅的に解析する実験も、順調に進んでいる。以上の理由により、当初の予定にしたがって、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究により、癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節領域における、CDX1とCDX2が結合するゲノム領域を同定した。今後、同定した結合領域を含むゲノム領域をクローニングし、ルシフェラーゼレポーター解析用のベクター pGL4.10Luc2に組み込む。そのレポーターを大腸癌細胞（DLD1またはLS174T）に導入し、癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節において、重要となるCDX1とCDX2の結合ゲノム領域を特定する。さらに、CDX1とCDX2が結合する配列（TATAAAA）を検索し、それらの配列に変異を導入する。その変異型レポーターを用いて、ルシフェラーゼレポーター解析を行い、CDX1とCDX2による癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節において、鍵となるゲノム配列を特定する。
CDX1とCDX2は、ホメオボックス転写因子である。転写因子は、複数のコファクターと協調して標的遺伝子の発現を調節する。そこで、CDX1またはCDX2と複合体を形成するタンパク質を、網羅的質量分析法により網羅的に解析する。同定したタンパク質のなかから、遺伝子発現に関係すると考えられるタンパク質を本解析の候補とする。その候補タンパク質と、CDX1またはCDX2とのタンパク質間相互作用は、免疫沈降法により確認する。さらに、CDX1とCDX2による癌幹細胞性関連遺伝子の発現調節に不可欠な候補タンパク質を選出するために、それぞれの遺伝子に対するshRNAを準備して、CDX1やCDX2の発現誘導細胞にそのshRNAを導入する。このとき、CDX1やCDX2によって生じる癌幹細胞性関連遺伝子の発現抑制をキャンセルするタンパク質について、さらに解析を進める。具体的な実験計画は、候補タンパク質の特徴に合わせて設計する。
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