| 研究課題/領域番号 |
18K06975
|
|---|
| 研究機関 | 沖縄科学技術大学院大学 |
|---|
研究代表者 |
柳谷 朗子 沖縄科学技術大学院大学, 細胞シグナルユニット, 研究員 (30608138)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 転写後制御 / インスリン生合成 / mRNA分解 / CCR4-NOT複合体 / 脱アデニル化 |
|---|
| 研究実績の概要 |
インスリンを産生する膵β細胞のグルコース応答性インスリン分泌におけるCCR4-NOT複合体による転写後制御の分子機構を、脱アデニル化活性のあるCNOT7のCnot7欠損マウスから単離した膵島を用いて解析した。その結果、Cnot7欠損膵β細胞ではインスリン生合成が阻害され、血糖を制御するホルモンであるインスリンの前駆体であるプロインスリンが増大し、成熟インスリン量が低下していることをウエスタンブロット法と電子顕微鏡像により明らかにした。Cnot7欠損膵β細胞におけるCCR4-NOT複合体による転写後制御の破綻がインスリン分泌不全を引き起こす分子機構を解明するのに、Cnot7欠損膵島を用いたRNA-seq解析を行った。インスリンの二次構造の形成に必須なプロインスリン分子内のジスルフィド結合を導入する protein disulfide isomerase (PDI) 酸化酵素であるペルオキシレドキシン4（Peroxiredoxin-4; Prdx4) のmRNA量がCnot7欠損膵β細胞で減少していることを明らかにした。さらにプロテオーム解析により、PRDX4が蛋白質レベルで減少していることを明らかにした。Actinomycin D処理した膵島におけるPrdx4 mRNA の安定性をRT-qPCR法により経時的に追跡した結果、Cnot7欠損膵島では、野生型膵島と比較してPrdx4 mRNAの安定性が低下していることを示した。ポリA鎖の長さを解析できるPAT法により、Cnot7欠損マウスの膵島ではPrdx4 mRNAのポリA鎖の長さが短縮しており、CCR4-NOT複合体がPrdx4 mRNAのポリA鎖の短縮化を介した転写後制御に重要な役割を担うことを示した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の研究では、RNA-Seq遺伝子発現解析結果を使用したエンリッチメント解析（DAVID）により、Cnot7欠損膵島において酸化還元反応に重要な役割を担う酵素が減少していることを示した。PDI酸化酵素であるPRDX4が減少することにより、インスリン生合成において重要な過程であるプロインスリン分子内のジスルフィド結合の形成が阻害されることを明らかにした。さらに、Prdx4 mRNA塩基配列上のRNA結合蛋白質の結合配列モチーフの解析により、Prdx4 mRNAのmRNA分解に関与していると考えられるRNA結合蛋白質を同定した。このように、Cnot7欠損マウスにおけるインスリン生合成不全を引き起こすと考えられる分子機構の概要を解明することができたので、今年度の本研究はおおむね順調に進展している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後は、Prdx4 mRNA に結合するRNA結合蛋白質やCNOT7に結合する蛋白質に焦点を絞って、インスリン生合成に重要な役割を担うCCR4-NOT複合体の転写後制御の分子機構を解析する。CCR4-NOT複合体はその構成分子に結合するRNA結合蛋白質を介して、標的mRNAに導入されてmRNA分解を制御する。Prdx4 mRNAとRNA結合蛋白質の相互作用をゲルシフトアッセイにより検討する。また、FLAGタグ標識をしたPrdx4 RNAとマウス膵島抽出液を用いて、抗FLAG抗体を使用したRNA免疫沈降により、Prdx4 mRNAとRNA結合蛋白質の相互作用を解析する。さらに、インスリン分泌細胞である膵β細胞株MIN6細胞において、Prdx4 mRNA結合蛋白質をノックダウンし、そのPrdx4 mRNAの分解に与える影響をActinomycin Dチェイス法により解析する。野生型とCnot7欠損膵島抽出液を用いて、CCR4-NOT複合体と相互作用するRNA結合蛋白質をその構成分子に対する抗体を用いた免疫沈降-質量分析（IP-MS）法により同定する。以上の実験により、インスリン生合成におけるCCR4-NOT複合体による転写後制御の分子機構を解析し、インスリン分泌不全に対する新規治療法の開発に繋がるようなインスリン生合成に重要な分子機構の解明を目指ざす。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本実験に必要な培養細胞とマウスの準備に当初の予定よりも時間が掛かった為、使用予定であった試薬を今年度は購入せず、2019年度に試薬を購入して実験を行う。次年度は、計画通りに研究が遂行されるように試薬を購入する。また、国内外の学会参加費も支出予定である。
|
