2020 年度実施状況報告書

低分子量G蛋白質Rapシグナル経路のプロテオーム解析を用いた癌浸潤機構の研究

研究課題

研究課題/領域番号	18K06984
研究機関	東京医科歯科大学
研究代表者	明石巧東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (60242202)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2022-03-31
キーワード	リン酸化チロシン / Src-superbinder / プロテオーム / 浸潤 / 癌 / LC/MS/MS質量分析
研究実績の概要	代表者はこれまでに癌細胞の浸潤に関与する分子の探索として二酸化チタンを用いて癌細胞中のリン酸化ペプチドの網羅的解析を行ったが同定したセリン/スレオニンリン酸化ペプチドと細胞運動関連経路との関連性を見出せなかった。そこで2020年度はリン酸化ペプチドの中でも微量であるがシグナル伝達との関係の密接なリン酸化チロシンペプチドを対象としてプロテオーム解析を行った。リン酸化チロシンと特異的に結合するSrc蛋白の144-252残基に3変異を加え結合性を高めたSrc-superbinder(Kaneko 2012)を大腸菌を用いて作製、sepharoseビーズに結合させた担体を作製した。この担体を用いて過酸化バナジル酸ナトリウム処理口腔扁平上皮癌細胞H01N01のLC/MS/MS質量分析を行った結果396個の独立したペプチドを同定し、その内243個がリン酸化チロシンペプチドであり、アフィニティ精製方法の特異性が確認された。本法を用いて肺腺癌組織4例についてリン酸化チロシンペプチドのプロテオーム解析を行った結果、207-399個の独立したペプチドを同定し、6-20個がリン酸化チロシンペプチド（ANXA2P2,ARHGAP35, ARHGAP42, CAV1, CD247, DYRK1B, MAPK1, MAPK3, MAPK13, MAPK14, MPZL1, PEAK1, PTPN11, PXN, RPS10, SHC1）であった。同定されたリン酸化チロシンペプチドの生物学的意義についてgene ontology解析を行った結果、細胞運動に関係する分子としてARHGAP35, CAV1, PEAK1, PXN, SHC1, PTPN11が同定された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由これまでに行ったTiO2をもちいたリン酸化ペプチドのプロファイリングにおいては得られたリン酸化ペプチドはセリン/スレオニンでありその多くは情報伝達には関与しておらず細胞運動に関係する分子を同定できなかった。2020年度においてはSrc-superbinder組換え蛋白の作製、リン酸化チロシンペプチド精製における特異性の確認、その結合担体を用いた臨床検体からのリン酸化チロシンペプチドの精製と同定、細胞運動に関与する可能性のある候補分子の同定に至った点で研究の進捗が得られた。一方、臨床検体からのリン酸化チロシンペプチドの同定数は少数であり、癌細胞の浸潤に関与する分子が同定されていない可能性は高く、リン酸化チロシンペプチドの同定数の向上が課題として残った。
今後の研究の推進方策	2021年度においては正常組織と腫瘍組織でのリン酸化チロシンペプチドプロファイルの違い、肺癌組織におけるARHGAP35, CAV1, PEAK1, PXN, SHC1, PTPN11の発現のの臨床病理学的な検索、そのチロシンリン酸化の癌細胞の浸潤能に与える影響の実験的検討、2018年度に細胞骨格関連分子として質量分析で同定した分子の臨床病理学的・実験的検討を計画している。