| 研究課題/領域番号 |
18K07001
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
柳澤 信之 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 准教授 (80337914)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | LAT1 / アミノ酸トランスポーター / 胆道癌 |
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| 研究実績の概要 |
L-type amino acid transporter 1（LAT1、SLC7A5）はがん特異的に発現していることから、がん型アミノ酸トランスポーターと考えられ、がんの診断のみならず予後バイオマーカーあるいは治療標的分子として注目されてきている。我々は胆管癌・膵癌において正常上皮よりもLAT1が発現亢進し、その高発現は独立した 有意な予後不良因子であることを報告した（Yanagisawa N. et al., Cancer Med., 2014ほか）。そこでLAT1高発現で新規阻害薬JPH203での効果が期待され、かつ悪性度の高い胆道癌細胞株について、LAT1機能解析・新規LAT1選択的阻害薬JPH203に対する腫瘍抑制効果の検討を行い、LAT1阻害薬によるがん治療効果等、臨床応用のための基礎的データを収集することを目的としている。 今回、ヒト胆道癌細胞株（HuCCT1・TFK1・HuH28・G415）を使用し、各細胞株において、１）各々の細胞増殖能を検討した。２）ホルマリン固定パラフィン包埋cell block切片を用いた免疫染色、３）Real time RT-PCR、４）western blottingでLAT1・LAT2の発現を確認した。これらの結果からTFK1がLAT1の細胞膜高発現・良好な細胞増殖能を示したためTFK1を選択し、５）siRNAによるLAT1のknock down実験６）LAT1阻害薬JPH203とゲムシタビンの細胞増殖抑制効果について検討した。siRNAによってwestern blottingで一時的なタンパク発現低下を確認した。ゲムシタビンは想定通りの細胞増殖抑制を示し、またJPH203もゲムシタビンと比較して弱いが細胞増殖抑制を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒト胆道癌細胞株（HuCCT1・TFK1・HuH28・G415）各細胞株の１）増殖曲線を作製し比較した。LAT1・LAT2の発現量については２）ホルマリン固定パラフィン包埋cell block切片を用いた免疫染色、３）東洋紡SuprePrepⅡ/KOD SYBR Setを用いて逆転写 によるcDNAを合成後、Real time PCR（ロシュ社LightCycler 480Ⅱ）、４）Cell lysateのwestern blottingを行った。これらの結果からTFK1がLAT1の細胞膜高発現が認められ、かつ細胞増殖能も高くRNAi実験に使用することとした。５）siRNAによるLAT1のknock down実験を行い、western blottingでタンパク発現低下を確認した。６）ゲムシタビン・抗LAT1阻害薬JPH203による細胞増殖抑制を検討した。この際、ゲムシタビンは想定通りの薬効が確認されたが、JPH203は特に高濃度試薬調整時の析出・薬効低下が問題となり、薬物実験系の進捗が若干滞っている。またshRNA系のプラスミド増幅が芳しくなく、ともに現在検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の予定として、各細胞株のLAT1・LAT2発現量を確認後、knockdown・overexpression目的に解析する細胞株を選択する。knockdown法についてはshRNA法のほか、可能であればゲノム編集法も検討する予定である。LAT1をstableにoverexpressionした細胞株とknock downした細胞株を各々作製し、ヌードマウス皮下に作製した細胞株を移植し腫瘍を形成させ、LAT1発現量による腫瘍増殖速度、組織像への影響について解析する。さらにマウスに抗LAT1阻害剤単独あるいは他の既存の抗がん剤との併用投与を行い、腫瘍径の変化を比較する。また胆道手術材料を用いて前癌病変Bil-INを加えて免疫組織化学的にLAT1・LAT2及びLAT3発現局在の解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた実験計画、特に動物実験系が滞っているが次年度に行う予定であり、今後の使用計画に大きな支障はないと考える。
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